基因分型的方法 - 仪器信息网.DOCVIP

应用说明：# MT 62 – fl ex系列 GOOD Assay-质谱分析单核苷酸多态性（SNPs）基因分型的方法 GOOD Assay是一种简单、可自动化分析单核苷酸多态性（SNPs）基因分型的方法。该方法将单管测试样品的制备和自动化、高可信度的MALDI-TOF质谱相结合，与其它应用质谱检测技术进行基因分型的方法相比，它不需要对测试的样品进行纯化。本文阐述了GOOD Assay的原理及其优点。 前言 　　近来公布的第一套完整的人类基因组DNA序列 [1]，对基因组的研究具有深远的影响。它将使得人类基因组中约30,000-120,000条基因的系统性识别成为可能。对这些基因的阐明可以使得有关基因之间的互相作用以及基因功能的研究深入下去，并最终开展基因与相应的遗传性疾病之间的关联研究。 个体间的差异和基因表型相关，所谓基因分型，就是对同一DNA区域不同变异的分析，可以用来识别患病人群中的易感基因，是一种基因筛查的方法。为了阐明基因，需要采用更快速、性价比更高的方法。有效的基因分型方法还可以深入应用到诸如药物基因组学、动物和植物繁殖和识别过程等领域之中，在药物基因组学中，可以根据每个病人的具体病情，应用这些研究方法为病人设计出个性化的药物。 本文介绍一种名为GOOD Assay的研究方法，该方法融合了等位基因特异性产物的制备和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱n”的数值在两个不相关的个体之间则是不同的。对某一个特定的微卫星序列，可以通过两个互补的、可以识别特异微卫星序列两侧保守区的寡核苷酸（引物），并依据PCR扩增产物的大小，来识别一个等位基因。在人类基因组中，大约每间隔一百万个碱基就可以发现一个微卫星序列。迄今为止已经有约5，000个微卫星序列被识别，并广泛应用于基因分型中。 第二种遗传标记物称之为单核苷酸多态性（SNP）。SNPs是指基因组中某一特定部位上某个单一碱基的变化。通常每个SNP只有两个等位基因，但是SNP出现的频率大约是间隔1，000个碱基左右。应用SNPs进行基因分型的首选方案详见参考文献[3]。 应用质谱测定SNPs基因分型 MALDI-TOF质谱仪似乎是完美的基因分型工具。它具有快捷、所需样标本量极少的特点，并且可给出绝对质量信息，根据这些信息就可以自动化等位基因分析。然而，应用MALDI分析DNA的最大问题之一就是待测样品的纯度。在最初应用MALDI进行DNA分析时，这一问题并不是非常突出，这是因为分析过程中应用的样品是合成的寡核苷酸[4]。而一旦这种技术被应用于基因组DNA，所应用的有效的纯化方法问题则凸现出来。可以采用分子生物学经典的纯化的方法，如沉降法和磁粒分离法等[5]。近来有关纯化方法的进展是某些反相材料的应用，如碳18（C18）或石灰石（Poros）等[6]。在某些特定的溶剂环境中，DNA可以与这些材料相结合，而在其它的溶剂环境中，DNA又可以被洗涤和洗脱。 目前，应用MALDI进行基因分型已经积累了一些比较成熟的模式，在这些模式中有关样品纯化的方法均为上述方法之中的一种或几种[7,8,9,10]。 对于GOOD Assay，我们设计了这样一种不需要样品纯化的策略。由于样品的纯化过程很难自动进行（尤其是当样品量非常少时），所以GOOD方法在这方面的优点是显而易见的。除此之外，该方法还允许在样品制备过程中使用最小限度的试剂用量。另外，质谱分析过程中基质制备的程序是从多肽分析的程序衍生而来，与标准的应用3-羟甲基吡啶Shrimp alkaline phosphatase，SAP酶）将反应体系中未被应用的dNTPs消化。 引物延伸：在体系中加入与待研究SNP距离很近的新引物，再加入新的DNA合成酶以及α-S-dNTPs和α-S-ddNTPs的混合物。这种混合物的选择标准是不同的等位基因形成的产物具有不同的碱基组成，可以被后续各自的质谱所区分。应用于引物延伸过程中的引物需要经过双重修饰，第一重修饰是该引物第二个碱基到最后一个碱基之间的某一个碱基被电荷所标记；第二重修饰是在这个被电荷标记碱基的任意一端加上硫代磷酸酯硫代磷酸酯磷酸二酯酶磷酸二酯酶μl，体系表面用甘油进行覆盖。这一反应体系是目前自动化液体操作设备所能够处理的最低限度。烷基化试剂用于去除覆盖在反应体系表面的甘油，因此MALDI分析过程中制备的产物不存在被甘油污染的问题。 在MALDI-TOF分析中，α-氰-4-羟-苯乙烯酸甲酯作为基质。这种基质支持GOOD Assay中反应产物的解吸附，并且可以抑制样品制备过程中的各种试剂成分。在MALDI分析的准备过程中，制备的样品以1：1的比例在微孔板中转移到MALDI靶上。质谱分析过程所用仪器为标准的MALDI-TOF质谱分析仪（Bruker Daltoni