2-DNA重组技术3.pptVIP

? 高分子量染色体DNA的制备： — 分离并纯化基因组DNA; — 部分和完全酶解,进行分级分离 — 收集大小合适的片段并与载体连接。 ? 体外重组连接：常用λ噬菌体DNA、考斯载体或粘粒作为载体，DNA 片段与载体用T4DNA ligase连接。  ? 包装蛋白的制备  ? in vitro packaging  ? 将重组DNA导入寄主细胞：体外包装λ噬菌体后，进行感染。 ? 筛选：用分子杂交，凝胶电泳，DNA序列测定等方法加以筛选和鉴定。 二、基因组DNA的片段化 1.用限制酶片段化: 用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部分离，直接和载体连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach) 存在的问题： ①所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段的混合群体。以每个载体可插入1～3kbDNA计算，基因库至少含10～30万个重组质粒。从中筛出目的基因工作量是很大的。 ②目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个基因分载在几个重组质粒上，筛出完整基因更不容易。 2.随机片段化： 超声波：可产生300bp的短片段。 高速搅拌：1500转/分×30分 可切 平均长度8kb的分子群体。 3.双酶消化 单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考虑到载体容量，如?噬菌体插