用琼脂糖凝胶制备电泳― 冻融法纯化质粒DNA1,2).pdfVIP

遗传 HEREDITAS(Beijing) 7(5);43-441985 用琼脂糖凝胶制备电泳— 冻融法纯化质粒DNA) 杨志兴王革伏 曲宝兰刘伟民李文贤陈 虹张云湖杨学成 （黑龙江省科学院应用微生物研究所，哈尔滨） 随着基因工程研究的不断发展，DNA做 剂均为分析纯。 为一种实验材料要求纯化方法更加简便，质量 二（）方法 更高。 目前关于质粒DNA的纯化方法已有许 1.菌体制备 前培养液以1多接种量接 多报道fs-5I。 国外多采用氯化艳密度梯度离心 于500mlLB培养基中，370C振荡培养4小时， 法，国内则限于条件，很少应用此法。我们建 使其。D，二。．6，加人氯霉素含（有氯霉素抗性 立了琼脂糖制备电泳— 冻融法，以纯化质粒 质粒的菌株除外），使其终浓度为170pg/ml。振 DNA及DNA的酶切片段。方法简便易行，而 荡培养12-16小时。4000rpm离心20分钟 且效果良好。 收集菌体后用ST缓冲液洗涤。最后菌体悬浮 于1/10原体积的ST缓冲液中。 材 料 和 方 法 2．质粒DNA粗提取液的制备 将上述 一（）材料 菌悬液加人溶菌酶，使其终浓度为 0.5mg/ml, 1.菌种 E.coli71一18 南（开大学蒋如 37℃水浴保温15分钟，取出后，依次加人5m 璋赠）。 NaCI,0.5MEDTA(pH8.5),20多SDS，使其终 2．质粒 四C4K 氨（基节青霉素抗性质 浓度分别为1.2M,30mM,1拓。每加人一种溶 粒，用Ap，表示，下同）；pUC7(Apt,Lac+); 液后轻轻混匀。将此裂解液放4℃过夜。次日 pVT15(Apt，带有免疫球蛋白重链可变区基因 20,000rp。离心 1小时，即获得含有质粒DNA VH);pAYCY184·1K·SupE·VKM 霉素7JL性 的上清液。 此上清液用等体积的氯仿一异戊醇 质拉，用Cm表‘示。此质粒带有免疫球蛋白轻 (24:1)反复抽提至两相界面无乳白色膜。取水 链.IK和VK基因，由日本京都大学T.Honj。教 相加人1/10体积3M NaAc(pH5.2）和二倍体 授赠)o 积冷无水乙醇，一20℃过夜。第二夭15,000rpm 3．试剂 琼脂糖，Serv。生产，进口分装。 离心30分钟，沉淀物溶于适当体积的TE缓冲 限制性核酸内切酶EamHf(5U/pl),EcoRI(2U/ 液中，即得质粒粗制品。 J1)，均由中国科学院生物物理所生化试剂厂生 3．质粒DNA的制备电泳分离与冻融法纯 产；溶菌酶由上海市禽类蛋品公司禽蛋二厂生 化 琼脂糖凝胶制备电泳采用水平式电泳槽 产；电泳缓冲液为醋酸缓冲体系 0（.04MTris-ac- (120mmX140mmX3mm)，三个加样槽每（槽 etate,0.002MEDTA);ST缓冲液，25外蔗糖， 为邓mmX3mmX3mm)，共可加样1.5mlo凉 O.1MNaCl,0.05M Tris-OH(pH7.5);TE缓冲 液，10mMTris-OH,1mMEDTA,pH8.0;LB培 YangLhixingexat.:PurifyingPlasmidsDNAbyAgrose 养基，1多蛋白陈,1外牛肉膏0.5外NaCl，培养菌 GelPraparativeElectrophoresis-Frozen and Thawed Method 体时，加人适量抗菌素，加人 Ap时，浓度为 1)本项目为中国科学院基金资助课题。 25z1g/ml，加人Cm时，浓度为10gg/ml；其它试 2)