第五讲 低压液相层析(色谱)技术.ppt

保持柱上端胶面平整、柱内无气泡和胶床不干裂十分重要。 为此，除加样时注意不破坏胶面平整外，在整个层析过程中，应在胶面上端保留合适体积的洗脱液(约1-2 cm柱高)，避免洗脱液滴入柱内时，破坏胶面的平整或可能造成胶床干裂。 2.不需要让柱流干至床表面，而是加入1％浓度的蔗糖来增加样品的密度； 3. 用一个毛细管和一个注射器或蠕动泵把样品直接传送到柱表面(如一些商品柱附有专门加样装置)。 洗脱 用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。 使用洗脱法溶剂与柱的相互作用比溶质与柱的相互作用弱，溶剂越过结合的分子，逐渐地将它们从柱上冲洗下来。 在冲洗过程中各组分因为吸附力不同而逐渐分离。 五、洗脱 六、流速及控制 洗脱液流速也往往影响层析的分辨率 在整个分离过程中，洗脱液通过柱时保持稳定的流速是十分重要的。 与流速有关的因素 所用介质的结构、粗细及数量； 层析柱大小，介质填装的松紧; 洗脱液的粘度、操作压等. 必须根据具体条件反复试验以确定一个合适的流速。 太高的流速使洗脱峰加宽，继而降低了分辨率； 过高时，有时会使流速先快后慢甚至发生阻塞。 流速可以通过调节“操作压”来控制，“操作压”相当于在柱上部的贮液瓶中溶剂的水平和柱出水口位置的水平之差。 获得稳定流速的另一方法是利用蠕动泵把洗脱液泵入或泵出柱，并保持稳定流速。 七、分部收集 洗脱液必须分成小部分收集，每一部分相当于2—5％的床体积。 这些部分一般被收集在试管中，使得在柱上已经分离的化合物仍然处于分离的状态。 每管收集的体积愈小，愈容易得到纯的组分。 已有各种商品的自动部分收集器(fraction collector) 。它们设计成当一个管中收集了一定量的洗脱液后一个新的收集管自动地接替了它的位置。 预先确定的体积转移到每一个管中，或用电子控制的方法使预定的滴数滴入每一管。在一个固定的时间内，让洗脱液进入每个管。 八、检测和合并收集 洗脱液按一定的体积分别收集于试管中，为了测定收集的各部分中各种成分的分布须用一些能特异地检测被分离化合物的方法来进行分析，一般可用直接或间接方法， 直接法: 分光光度法、光折射法、荧光法和放免法等。 间接法: 化学显色法、等电聚焦法、电泳法、薄层层析法和生物活性测定法等。 如果某一化合物具有特征性物理特性，对可见光或紫外光有吸收，如蛋白质在280nm，核酸在260nm处有最大的吸收。可用核酸白质检测仪。 洗脱液的合并方法对目的物质量和产量有较大的影响。 欲得高纯度的化合物，一般根据洗脱峰位置收集合并较窄的部分； 欲得产量较多目的物，则合并较宽部分。 九、洗脱峰的纯度鉴定 由于检测系统的分辨率有限所以一个对称的洗脱峰并不一定代表一个纯净的组分。 如果洗脱峰峰形不对称，或出现“肩”(shoulder)，则表示混有杂质。 对在一个特定的柱层析分离条件下显示出的每个峰要用几个纯度标准(一般2-3个高分辨率方法)来检验，才能确定它的均一性。 例如，可采用SDS电泳法、等电聚焦法、高效液相层析法和测定N末端氨基酸残基方法等。 十、脱盐和浓缩 洗脱峰在纯度鉴定的基础上，将同一组分合并。 若欲得到某一产品，有必要依次经过减压薄膜浓缩法或超滤(去盐、去水)，透析去盐 再用冰冻干燥或有机溶剂沉淀等方法处理，得到干粉或沉淀。 科研、生产中要得到高纯度组分，往往要经过几次柱层析 每次柱层析后，某一峰的洗脱液可依次用透析法除盐 超滤或减压薄膜浓缩法将样品浓缩到一定体积后，再上第二次柱。 十一、凝胶的再生及保存 1、再生(一般无需做再生处理) 用过的凝胶经0.5M的NaOH(含0.5M的NaCI)混合液浸泡 当污染严重时用0.5MHCl做短暂处理 2、防霉 0.02%叠氮钠或0.002%双氯苯双胍己烷 3、凝胶的保存方法： 湿态 加入防腐剂后低温保存（-4 ℃） 半收缩态 水洗净后滤干，用60%-70%的乙醇洗涤，使凝胶体积缩小，低温保存。 干态 水洗净后滤干，用60%,70%,90%, 95%,的乙醇逐步脱水，再用乙醚洗去乙醇，干燥 保存。切忌开始就用浓乙醇,防止结块。 第五章 低压液相层析（色谱）技术 慢 中等 快 色谱分离 Temporal course 淋洗液 液相色谱法：以液体为流动相的色谱法称～。 经典液相色谱：固定相颗粒较大且不均匀 常压下输送流动相 柱效较低 分析周期长 现代液相色谱：固定相颗粒小且均匀