基质金属蛋白酶抑制剂对脑外伤后大鼠神经保护作用.doc

基质金属蛋白酶抑制剂对脑外伤后大鼠神经保护作用摘要　目的：研究基质金属蛋白酶抑制剂对大鼠颅脑外伤的神经保护作用。方法：利用自由落体撞击装置，制作脑外伤模型。将大鼠随机分为实验组(n＝32)和对照组(n＝32)，撞击前1天经侧脑室给药，实验组和对照组分别给予基质金属蛋白酶抑制剂和生理盐水，撞击后6小时、24小时、3天、7天分别处死大鼠，TUNEL法检测海马区细胞凋亡情况。结果：撞击后6小时、24小时、3天实验组较对照组神经功能评分明显减少(P0.05)；神经元的凋亡也有显著减少(P0.05)。结论：基质金属蛋白酶抑制剂对脑外伤后大鼠有神经保护作用，其作用机制可能与阻止神经细胞凋亡有关。 关键词　基质金属蛋白酶抑制剂；凋亡：神经保护 近年来基质金属蛋白酶(MMPs)在脑外伤后的作用开始被研究者关注。本文采用动物实验方法，评价基质金属蛋白酶抑制剂(CTT)对脑外伤的疗效。 1　材料和方法 1．1　实验试剂：CTT(BIOMOL公司产品)，TUNEL检测试剂盒(武汉博士德公司)，其他试剂均为市售分析纯产品。 1．2　动物模型制备：2～3月龄健康SD大鼠64只(250～300g/只)雌雄各半。将大鼠随机分为实验组(侧脑室注射CTT)和对照组(侧脑室注射生理盐水)。每组按处死时点的不同分为4个亚组，分别为6小时8例、24小时8例、3天8例、7天8例。用10％水合氯醛300 mg／kg腹腔注射，麻醉后对实验组和对照组动物经侧脑室注射CTT或生理盐水各10ml。第二天利用Marmarou等学者的自由落体撞击法制造脑外伤，撞击重量50 g，撞击高度1.5米。 1．3　神经症状评分：脑外伤后在各处死时点采用Longa和Kat－sumata等的方法观察并记录大鼠神经功能缺失症状。 1．4　TUNEL法测凋亡：大鼠经过生理盐水和4％多聚甲醛快速灌注后，完整取出脑组织，注意软脑膜剥离干净。将脑组织置于4％多聚甲醛浸泡3～4小时后。移入30％蔗糖溶液4℃下浸泡沉底2天。固定后的脑组织作20 μm厚的冰冻切片，再经TUNEL试剂盒处理后苏木素染色，400倍光镜下记数阳性细胞数。 1．5　统计方法：结果用均数±标准差表示，采用SPSS11.5统计软件，以单因素方差分析t检验作差异的显著性分析。 2　结果 2．1　两组大鼠神经症状评分：见表1、图1。 2．2　CTT对脑外伤后神经元凋亡的影响：在实验组和对照大鼠的海马部可以见到一定数量的TUNEL染色阳性的凋亡细胞，见图2、表2。 3　讨论 MMPs是一组与锌有关的金属蛋白酶，主要功能是降解和再塑造细胞外基质。该酶在正常的胚胎发育，组织塑型和一些疾病如膜性肾病、多囊肾、动脉粥样硬化、多种结缔组织疾病、关节炎和肿瘤转移等的发生发展中起着重要作用。试验中使用的CTT是一种人工合成的基质金属蛋白酶抑制剂，它能够特异性的抑制明胶酶MMP－2和MMP－9，而对MMP－8，MMP－13，MP－14等无抑制作用。 本研究在自由落体脑外伤模型的基础上，观察CTT对脑创伤后大鼠脑组织的保护作用。结果显示：使用CTT治疗后的各时点大鼠神经功能评分均减少，尤以伤后24小时、6小时、3天显著；在实验组中，伤后6小时可以观察到凋亡细胞，随后凋亡细胞数呈进行性增加，在第三天时达到峰值，后逐渐下降，该结果与目前国内学者研究结果基本相同，与神经症状评分结果一致的是在伤后24小时、6小时、3天两组的凋亡细胞数比较也有显著差异。造成这种现象的可能原因是实验中使用的CTT是一次性注射，其在动物体内的有效作用时间有限，因此在撞击后早期均能观察到CTT对凋亡的影响，而在7天后其动物体内的有效浓度不足以抑制MMPs，而不能发挥阻止细胞凋亡的作用。以上结果间接说明CTT对脑创伤后大鼠有一定的神经保护作用。作用机制可能有两个方面：(1)MMPs促进失巢凋亡。通常器官细胞团聚在一起。紧密地黏附于细胞外基质，形成自己行使功能和赖以生存的“家”。一旦它们脱离细胞黏附基质，失去细胞间联结。则会遭受细胞凋亡。这种细胞死亡形式于1994年被首次命名为“anoikis”一源自希腊语。研究表明细胞与细胞外基质成分的黏附。主要由整合蛋白介导，而后者对失巢凋亡却起着一定的介导作用。但有赖于细胞类型和所选择的失巢凋亡模型。此外大量的蛋白激酶信号介导分子以细胞基质黏附为媒介而成为失巢凋亡的重要调节因子，如FAK(黏着斑激酶)，ILK(整合蛋白连接激酶)和She(一种衔接蛋白)。Devin等国外学者在2003年的研究也指出凋亡与ILK在内的机制有关，CTY能通过抑制MMPs而保护整合素受体不被水解破坏，使其发挥特有生理功能。最终阻止海马部神经元的凋亡；(2)S一亚硝基化诱导的凋亡。在2005年的