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定点突变问题经验交流 篇一：定点突变问题经验交流 定点突变问题交流 我现在做定点突变3个月,可是一直变不回去!我的基因长1700bp,要突变的碱基在600bp处,用的宝生物的突变试剂盒,每次按说明书实验后一测序,就是没有突变掉.试剂盒里的酶用的是pyrobest高保真的 ，高保真的一般扩增长片断有点难，后来我又用了LA酶，但这个酶在扩增后产物末端会多个A，也不行 ！求高手指点一下，三个月过去了 没有个结果，急啊 ！ 你的这个基因太长，而且你要突变的碱基在600多的位置，不好突变，也没有办法突变。因为在中间没有办法通过引物来引入突变碱基。我建议你把你的片断分成两端来扩，一段有突变，一段没有突变，分别设计引物，最后把这两段连起来就可以了，当然这样做是很麻烦，至少可以去试一试。 突变是可以的，把基因片段连接到一个载体上，然后在要突变处设计一对反向互不的引物，三十多个碱基的，把要突变的碱基放在正中间，然后拿构建好的载体当模板扩增，再用dpnI消化掉质粒模板，将已经形成环状的PCR产物（带两个缺口）转化进大肠杆菌就可以。 具体的方法原因可以参考分子克隆，strategene公司、赛百盛公司也有这类的定点突变试剂盒。takara的那个试剂盒应该也可以，但我总觉得那些步骤对操作要求太高，还要乙醇沉淀什么的，太麻烦。 我最近在做跟你一样的，基因也是1700，在600bp也有一个突变，不过还有其它的突变位点，我是这么做的：在突变位点设计两个引物，一个正义，一个反义，当然在引物中已经包含突变了，而且两个引物完全互补共25bp。用这两个引物分别和上游和下游的另外两个不含突变的引物在模板也就是质粒上面扩增（用高保真酶），得到没有末端加A的600bp和1100bp片段，然后重叠PCR得到突变的全长基因（因为他们有25bp的重叠），我现在已经做成功四个了，还有三个没有成功（共七个点突变），正在努力。这种方法分子克隆上面有，另外我还试过另一种方法，大引物法，就是用刚才这个600bp的片段做引物在原模板质粒上面做单引物扩增20循环，然后加两边的引物，这样也能做出来，但是这里因为加了原模板，所以不能保证它完全突变了，需要筛克隆（这个分子克隆上面也有，你可以参考一下。 刚看了看takara的说明书，我想有个地方要问一下：你用来扩增的模板是线性的1700bp的片段还是一个含这个片段的质粒？如果是质粒，在转化之前，有没有把这个质粒去掉？质粒转化跟跟连接片段的转化相比，可是太有优势了，最后你挑克隆的时候，自然多数机会挑到的都是这种没有任何突变的“原始质粒”，哪怕你最初只用了0.1ng的模板。 bact wrote: 刚看了看takara的说明书，我想有个地方要问一下：你用来扩增的模板是线性的1700bp的片段还是一个含这个片段的质粒？如果是质粒，在转化之前，有没有把这个质粒去掉？质 粒转化跟跟连接片段的转化相比，可是太有优势了，最后你挑克隆的时候，自然多数机会挑到的都是这种没有任何突变的“原始质粒”，哪怕你最初只用了0.1ng的模板。 我用的是质粒呀，但是PCR出来后会切胶回收呀，所以肯定不会有质粒了呀，只是还有少量产物是以没有突变的质粒为模板扩出来的，所以要筛选。但是重叠PCR就不用筛选了，每一步都回纯化呀。 感谢这么多高手的指点!bact,你好!我就是把目的片段连接到了一个载体上,加上载体共3kb左右吧,我就是按你说的方法做的,但我没有用dpnI消化掉质粒模板这一步.我是在PCR后做磷酸化,再连接,使产物重新成为环状,再转到大肠杆菌,刚开始时p出的产物和对照一般大,但转化后都是未突变成功.再后来P出的产物总比对照小,不知道为什么.是不是我的基因太长了(3kb),高保真酶效率太低,后来我又换了LA酶,但该酶在PCR产物后都会加个A,没办法使其再环化,能有什么办法把A去掉?请各位高手继续指点! bleding,你好,用重叠PCR的方法扩1700bp长度的基因,用什么酶好呢,保真性好的扩增效率低,扩增效率高的保真度不好吧? lielieyuyu wrote: bleding,你好,用重叠PCR的方法扩1700bp长度的基因,用什么酶好呢,保真性好的扩增效率低,扩增效率高的保真度不好吧? 长了确实不是那么容易做，我也是试了好多条件才试出来，将近做了一个月，天天P。你最好用一个好点的酶，我用的是TIANGEN的2*mix，然后加的PFU。现在还刚转进质粒，还没有测序验证，所以还不敢保证没有其它的突变。我觉得你那个方法也挺好的，只是应该消化一下原模板。 我在PCR后会跑电泳胶回收的啊,原来的质粒模板应该不会有了吧? 此帖加精，欢迎讨论突变技术！ lielieyuyu,你的质粒是3k的，平常提取出来的超螺旋状态在电