不同ev71灭活疫苗诱导小鼠tlrs应签的比较探究.pdfVIP

TheImmune toDifferentEV71VaccinesLeadto Response DifferentActivitionLevelof inMice TLR4，7，9 ADissertationSubmitted totheGraduateSchoolofHenanNormal University in Fulfillmentofthe Partial Requirements ofScience forthe ofMaster Degree By Shaojie qiang Supervisor：Dr．Shao Dr．LiangZhenglun May2013 摘要 内流行，亚太地区为主要流行区。EV71感染和发病人群主要为5岁以下婴幼儿。EV71 感染可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经性肺水肿和脊髓灰质炎样麻痹等多种神经系 统疾病，有较高的致残率、致死率，被认为是脊髓灰质炎病毒之后影响儿童健康最主要 的肠道病毒之一。我国是最早开展EV7l疫苗研发的国家，目前3个厂家的全病毒灭活疫 苗即将完成Ⅲ期临床试验。但对该疫苗的基础研究较为滞后，免疫机制仍不十分清楚， 成为全面评价疫苗免疫原性及安全性的瓶颈。 Toll样受体(TL黜)，是模式识别受体(PI洮)的一种。处于沟通固有免疫与获得 性免疫的核心地位，TLRs信号通路的激活不仅诱导机体产生炎症反应，同时也促进DC 的成熟与Th细胞的分化，产生获得性免疫应答病源体入侵机体时与相应的PRRs特异结 合，激活体内免疫信号调节通路，最终诱导机体产生炎症反应。在对麻疹、黄热、风疹、 乙肝等疫苗免疫机制的研究中，均发现存在特异激活的TLRs信号通路。有研究表明黄热 疫苗高效的免疫原性与其可同时激活多条TLRs通路相关。此外将TLRs配体作为更加安 全、有效的新型疫苗佐剂的研究也成为疫苗学研究的热点，葛兰素史克公司生产的添加 居世界领先，但目前仍不了解疫苗诱导免疫应答与TLRs信号通路的关系。 本研究成功设计了小鼠TLR4、7和9引物与探针，分别构建了包含TLR4，7，9基因的重 组质粒，并在大肠杆菌中成功克隆了该质粒。引物、探针与重组质粒构成了小鼠TLR4、 抗原的小鼠血清中和抗体水平进行了测定，证明不同EV71抗原在接种剂量下皆可诱导 小鼠产生中和抗体，且接种后3d阳转率即达至U100％，据此判断TLRs通路的激活应发生 在接种后3d内，因而对小鼠TUH，7，9基因检测应在接种或刺激后3d内进行。 运用Q-PCR平台对体外经EV71抗原刺激3d内不同时间点的小鼠脾淋巴细胞中 抗原中存在差异，提示TLR4、7和9基因在不同EV71抗原免疫应答过程可能发挥不同的 T 作用，并且TLR4、7和9基因活化水平与刺激抗原量之间存在剂量效应关系，该结果在 基因敲除小鼠上得到了验证。对TLR4、7和9信号通路在不同EV71疫苗免疫应答过程中 活化作用的研究，初步揭示]EV71疫苗的免疫机制。 关键词：肠道病毒71型(EV71)，Toil样受体，中和抗体，定量PCR技术，疫苗 II A