柱分离步骤详细信息.doc

操作流程： 吸附剂用量的确定→柱子的选择→装柱→柱留体积的测量→加样或拌样→洗脱→分部收集→检测→合并→浓缩 材料选择： 硅胶：吸附色谱——1g样品/20～50g ，特例1g样品/500～1000g，用前最好120烘24h，可不做活性测定。分配色谱——1g样品/100～1000g，特例1g样品/10000g。 色谱柱的选择：径长比一般为1:10～1 :20，特例1:40； 一般吸附剂应填充到柱子体积的1/4～1/5左右。 湿装法装柱： 准确量取一定体积的溶剂倒入称量好的吸附剂，间歇性搅拌数次，静置过夜，次日在搅拌下装柱。将湿硅胶一次倒入已处理好的柱内，打开下口开关，让水缓缓流出，在吸附剂下沉的同时，可用橡皮塞对称轻轻敲击色谱柱，使吸附剂装填均匀。待液面降至吸附剂顶部1厘米处时，关住下口，量取流出体积，求出柱内保留体积（加液量-流出液量），并以此确定开始收集洗脱液的时间。然后再加压用淋洗剂“走柱子”，4-5ml/min的流速过柱，待最后通过柱的蒸馏水在吸附剂上端约1厘米时，关住下口，上样。加样： 将样品溶于合适的溶剂，在不扰动吸附剂层面的情况下，加到柱体上面。然后在样品上部放一层石英砂。以免洗脱剂破坏硅胶面平整。最后在用少量清洁溶剂对主壁洗涤2～3次。 必须注意在洗脱的过程中，尤其是开始阶段，不能扰动层面。洗脱速度一般为每分钟流出1/200柱留体积左右。对于梯度洗脱需注意标记不同溶剂的分界管号。 分部收集：一般每管收集1/20～ 1/10柱留体积 检测：确定目标物的位置及纯化情况 ①薄层色谱或纸色谱检测； ②气相色谱或液相色谱检测； 合并：成分相同或相似的收集液合并，交叉部分单独收集。 浓缩：旋转蒸发出去溶剂获得纯产品；确保烧瓶干燥干净。 选取固相萃取小柱（规格：0.5x7cm），柱层析硅胶，粒度为0.075-0.15 mm，比表面积大于500m 吸附剂处理及制备： 把柱层析硅胶用二氯甲烷索式抽提36 h至无荧光，待溶剂挥发后在200 ℃下活化4 h，干燥器中冷却，称取一定量处理好的硅胶装入固相萃取空柱中。 洗脱实验： 称取一定量的样品，置于固相萃取柱的上端，根据洗脱顺序依次加入一定量的正己烷、二氯甲烷和无水乙醇洗脱溶剂来洗脱样品中的饱和烃、芳烃和胶质组分（主要为极性物质）。正己烷加入到一定体积时，用表面皿取一滴下端流出的洗脱液，滴加一滴指示剂（甲醛，滴加到1 mL 浓硫酸中，混匀），红色出现说明正己烷洗脱剂把芳烃中的单环芳烃组分带出；此时马上换一个接收瓶，再加入一定量的二氯甲烷洗脱芳烃组分，观察吸附在萃取柱上黑色胶质环的移动来判断二氯甲烷的加入量，当黑色胶质环移动到固相萃取柱的最下端时，表明芳烃组分已经全部流出，此时停止加入二氯甲烷，更换另一个接收瓶，再用无水乙醇洗脱，最后把胶质组分洗脱下来。 分离优化： 当固相萃取材料与样品重量比为30-50∶1、饱和烃洗脱溶剂与样品的重量比为40-45∶1、饱和烃溶剂洗脱速率为30 mL/min 时，达到的分离效果最好。注：C18这样 HYPERLINK /search?word=%E5%A1%AB%E6%96%99fr=qb_search_expie=utf8 \t _blank 填料用来做 HYPERLINK /search?word=%E5%9B%BA%E7%9B%B8%E8%90%83%E5%8F%96fr=qb_search_expie=utf8 \t _blank 固相萃取的材料 1、C18 HYPERLINK /search?word=%E5%9B%BA%E7%9B%B8%E8%90%83%E5%8F%96fr=qb_search_expie=utf8 \t _blank 固相萃取小柱的购买 2、柱层析硅胶的前处理 正相，是固定相比流动相极性大，适合做极性物质，反相柱，流动相极性比固定相极性大，适合做非极性化合物，所以流动相都是极性比较大的，水，甲醇，乙腈组成 我们一般说反相色谱和正相色谱，反相色谱就是固定相的极性小于流动相，正相色谱则相反。这样引伸出来一个反相柱和正相柱。目前，一般反相柱就是在高纯硅胶基质上键合上一定的非极性基团或极性较低的基团的柱子。而正相柱一般是完全裸露的羟基基团或氧化铝。至于使用的范围就简单了。色谱的原理就是溶质在固定相和流动相之间的反复分配造成分离。这样的话，你想，如果非极性的化合物在正相柱上的固定相上没有作用力或作用力很小，你说这样能完成分离或分离效果会好吗？顺便提一下，现在正相色谱使用的比较少。首先，正相色谱一般用非极性的流动相如正己烷等，这样系统中应避免进入水分等难溶或不不溶物质；其次，现在有很多衍生手段或流动相添加剂使一些极性化合物在反相柱上保留分离。 ⑴反相柱：填料是非极性的，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、C4等