细胞酪氨酸酶tyrosinase活性比色法定量检测试剂盒产品.doc

细胞酪氨酸酶（tyrosinase）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 细胞酪氨酸酶（tyrosinase）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过酪氨酸酶反应系统中底物酪氨酸氧化后，产生多巴色素，呈现吸光峰值的变化，即采用比色法来测定细胞裂解悬液样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种人体和动物细胞，尤其是黑色素细胞和黑色素瘤细胞裂解悬液样品中酪氨酸酶的活性检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。 技术背景 酪氨酸酶（tyrosinase；EC1.14.18.1）是一种单酚单加氧酶（monophenol monooxygenase），又称为单酚酶（monophenolase）或单酚 二羟基苯丙氨酸：O2 氧化还原酶（monophenol dihydroxyphenylalanin：O2 oxidoreductase），具有双功能的含铜糖蛋白，广泛存在于植物、酵母和动物组织中，其蛋白结构、大小、糖基化方式、激活特征等都不同。人体酪氨酸酶是一个跨膜蛋白，而催化结构域在黑色素细胞（melanocyte）或色素细胞的黑色素器（melanosome）里。酪氨酸酶通过催化L-酪氨酸（L-tyrosine）等的o-羟基化（o-hydroxylation）反应变成L-多巴（L-dopamine），进而氧化产生黑色素底物多巴醌（dopaquinone），从而由多巴色素（dopachrome）转化为黑色素（melanin）中的真黑素（eumelanin），以及其它色素，包括毛发和眼睛色素。紫外线可以激活酪氨酸酶活性，严重时，会引起色素沉着（hyperpigmentation）。酪氨酸酶基因突变将导致I型眼皮肤白化病（oculocutaneous albinism）。酪氨酸酶抑制剂成为增白化妆品的重要元素。基于底物酪氨酸，在酪氨酸酶的催化下，产生多巴色素，通过其吸光值的变化（475nm波长），来定量测定酪氨酸酶的活性。其反应系统为： tyrosinase L-tyrosine + 1/2 O2 → H2O + L-DOPA tyrosinase L-DOPA + 1/2 O2 → H2O + dopachrome 产品内容 清理液（Reagent A） 120毫升 裂解液（Reagent B） 10毫升 缓冲液（Reagent C） 20毫升 底物液（Reagent D） 2毫升 阴性液（Reagent E） 500微升 产品说明书 1份 保存方式 保存 裂解液（Reagent B）和 底物液（Reagent ）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；液（Reagent D）避免光照，有效保证6月 用户自备 1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器 15毫升锥形离心管：用于样品制备的容96孔板实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的置入冰槽里融化。避免光照。然后进行下列操作。 样品准备 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞） 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），覆盖生长表面 小心抽去清理液 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化） 加入3毫升 清理液（Reagent A），混匀细胞 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始） 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g 小心抽去上清液 加入500微升 裂解液（Reagent B），充分混匀 转移到预冷的1.5毫升离心管 强力涡旋震荡15秒 置于冰槽里孵育30分钟 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415） 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作测定准备 准备好上述待测样品，置于冰槽里 设定好分光光度仪（温度为℃）：波长4nm 缓冲液（Reagent ）背景对照测定 移取0微升 缓冲液（Reagent ）到新的比色皿加入0微升 底物液（Reagent ）加入50微升 阴性液（Reagent ） 上下倾倒数次，混匀（25℃ 即刻放进分光光度仪检测，此为背景 样品测定 移取0微升 缓冲液（Reagent ）到新的比色皿 加入0微升 底物液（Rea