人血清白蛋白合人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的克隆表达.pdfVIP

中文摘要 目的构建重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子（pPIC9K-HSA-hG-CSF）表达载 体，用电转化方法将线性化重组表达载体质粒pPIC9K-HSA-hG-CSF 转化整合入 毕赤酵母宿主菌 SMD1168 中，甲醇诱导表达出具有生物活性的融合蛋白，对 转化子进行Western-blot 检测,用小鼠骨髓白血病细胞（NFS-60 ）细胞检测其 生物学活性。方法 PCR 扩增出人血清白蛋白基因（HSA）和粒细胞集落刺激因 子基因（hG-CSF），GGGGS 作为小肽接头，采用重叠PCR 的方法将HSA 和hG-CSF 拼接起来，与质粒载体pPIC9K 连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH-5α 。抽提质 粒，用 SalI 酶切重组质粒，电转化法导入毕赤酵母 SMD1168 中，通过表型筛 选和诱导表达实验得到蛋白表达工程菌。将阳性转化子进行 PCR 鉴定和 Mut 表型鉴定并用甲醇诱导表达，将表达上清进行 Western-Blot 鉴定， NFS-60 细 胞测活实验测定其体外生物学活性。在摇瓶培养条件下，初步研究了甲醇诱导 浓度及菌体诱导起始OD600 值两因素对转化子表达水平的影响。结果 通过PCR 扩增技术成功