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维普资讯 植物生理学通讯 第44卷 第2期，2008年4月 323 愈创木酚法测定植物过氧化物酶活性的改进 李忠光 ，龚明 云南师范大学生命科学学院，昆明650092 “过氧化物酶活性的测定”是植物生理学呼 2过氧化物酶酶促动力学 吸作用一章中必做的实验 内容，其 目的是让学生 由于以酸终止酶促反应实验结果明显偏低 ， 掌握愈创木酚法测定植物过氧化物酶活性的原理和 为了更准确地测定植物过氧化物酶活性，我们 以 方法，了解过氧化物酶在植物生长发育和抵抗不 愈创木酚为底物，反应体系中加入酶液后，每30 良环境 中的作用 。但是，在教学中，我们发现 S测定A 。的增加值(即产物4．邻 甲氧基苯酚形成的 按照几种植物生理学实验指导书中的方法(白宝璋 量)代表植物过氧化物酶活性的大小，以时间对 和汤学军 1993；高俊风2006；王学奎 2006)~定 △A 。作图，得到过氧化物酶酶促动力学 曲线(图 的植物过氧化物酶活性明显偏低。因此我们进行 1)。显示，在0—3．5min内，随着酶促反应时间 了如下的探讨和改进 ，与广大 同行共切磋 。 的增加，A 。也随之增加，表现出较好的线性关 1酸对过氧化物酶酶促反应的终止效应 系，符合 比耳定律(A=KLC)的条件。但是，当反 一 l O O O O O O O O O 般的植物生理学实验指导书中的过氧化物 应时间超过 3．5min后，反应速度 明显降低 ，不 酶活性测定常用三氯乙酸(TCA)或偏磷酸(I-IPO)终 符合比耳定律。所 以在过氧化物酶活性的测定 止酶促反应(白宝璋和汤学军 1993；高俊风2006； 中，如果反应超过 3．5min，必然导致实验结果 王学奎2006)，我们发现这两种酸终止的光密度 不同程度 的偏低 ，说服力不强。因此，我们认 A 。都显著降低(表 1)。为了寻找合适的可用于终 为应该以反应 3min计算酶活性。 止反应的酸，在反应启动后 3．5min(即向反应体 系加入酶液3．5min后)，除立即用TCA或(HPO) 以外，我们还用 HSO 、HC1和HPO 终止反应， 与加酸前的对照(即反应3．5min时的A 。值)相比， 其A 。值有不同程度的降低(表 1)，加酸后 由于稀 释的原因A 。的影响已经作了折算。说明在植物 过氧化物酶活性的测定中，用酸终止反应是不适 合的，否则测得的值即明显偏低 ，其原因可能是 反应产物4．邻 甲氧基苯酚在酸性环境中不稳定造 时间 ／min 成 。这些结果表 明一些实验指导书中用 TCA或 图1过氧化物酶反应动力学曲线 (HPO3)，以及H2SO4、HCI和H3PO4终止反应值 得商榷 。 3 两种测定植物过氧化物酶活性方法的比较 为了检验 “反应