第七章沉淀技术.ppt

硫酸钠：低温时溶解度较低，但不含氮，适于热稳定性高的胞外蛋白的盐析。 磷酸盐、柠檬酸盐：缓冲能力强，但溶解度低，易与某些金属离子生成沉淀。 * * 第八章 沉淀技术 概念：加入有机或无机沉淀剂或改变环境条件，使目标物溶解度降低而沉淀下来的分离方法。 分类：盐析法；有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；成盐 沉淀法等。 从液相中析出固相，属初级分离纯化技术 具有浓缩和初步分离作用 缺点：形成不定形固体颗粒，构成成分复杂，易夹杂共存的杂质、盐、溶剂等物质。 原理： 1. 盐离子的水合作用降低了自由水的浓度，摧毁了蛋白质的水化层，疏水区露出使生物分子相互聚集而沉淀。 2. 盐离子中和了蛋白质表面的电荷。 第一节 盐析沉淀法 ※ 低盐浓度——盐溶，高盐浓度——盐析 一、盐析原理 概念：利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。 硫酸铵缺点： 水解变酸；高pH释放氨气；残留影响风味；有一定的毒性。 二、常用的盐析剂 常用盐析剂：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠等 选择依据： 价廉，废液可肥田 分级效果好 溶解度大且随温度变化小 能使蛋白质稳定 其他几种盐的特点： 1.加50mmol/L磷酸缓冲溶液，防止变酸。 2.进行硫酸铵盐析要预先进行分级试验，逐级沉淀分离。 3.温度升高蛋白质溶解度降低（高盐），一般控制在4℃左右。 4. pH一般控制在等电点。 5. 盐析沉淀产品最后要脱盐。 三、硫酸铵的使用规则 使用硫酸铵应注意的问题： 硫酸铵的加入方式： 直接加入固体粉末 加入硫酸铵饱和溶液 应用：免疫球蛋白和酶的提取纯化，中药三七皂甙的提取，人干扰素等 机理： 1.亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，溶质分子的水化度降低，溶质分子间静电引力增加，易聚集形成沉淀。 2.亲水性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。 第二节 有机溶剂沉淀法 一、原理 概念：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。 优点：溶剂易蒸发除去或离心除去，分辨率较盐析高 缺点：易使蛋白质变性；溶剂易挥发、易燃、易爆，安全性要求高；使用量较大，成本高 二、常用的有机沉淀剂 乙醇、丙酮 选择时考虑的因素： 介电常数小，沉淀作用强 对生物分子变性作用小 毒性小，挥发性适中 能与水无限互溶 丙酮：沉淀作用大于乙醇，沸点较低易损失，燃点低，有肝脏毒性 乙醇：沉淀作用强，沸点适中，无毒，最常用 低温、少量多次加入，加入时缓慢搅拌 有机溶剂加入水中——发热，控制温度 等电点沉淀 控制适宜pH值，注意使同种溶液中目的物与主要杂质带同种电荷 少量盐存在能保护蛋白质 助沉剂：低浓度的单价盐，如醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等； Zn2+、Ca2+等 三、使用原则 第三节 等电点沉淀法 原理：两性电解质，在溶液pH处于等电点（pI）时分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。调节溶解的pH值，使两性溶质溶解度下降，析出沉淀的操作。 优点：操作简便，溶剂消耗少，引入杂质少 缺点：等电点沉淀常不完全 等电点沉淀法的操作条件：低离子强度；pH≈pI