a－荧光分子的吸收系数.PPT

荧光光度分析法 一、基本原理 　　　在紫外光或波长较短的可见光照射后，一些物质会发射出比入射光波长更长的光 --------荧光。以测量荧光的强度和波长为基础的分析方法叫做荧光光度分析法。 　　　假设分子在吸收辐射后被激发到S2以上的某个电子激发单重态的不同振动能级上，处于较高振动能级上的分子，很快地（约10-12 ~ 10-14 s）发生振动松驰，将多余的振动能量传递给介质而降落到该电子的最低振动能级（V=0），后经由内转化及振动松驰而降落到S1电子态的最低振动能级，处于S1电子态的激发分子，其分子内的去活化作用有如下三种途径： 　　　式中K为常数。因此，在低浓度的情况下，荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。 图A为一极稀的溶液，在入射光I0照射下所发生的荧光均匀地分布在液池中；图B为较浓的溶液，入射光被液池前部的荧光体剧烈吸收后而发生较强的荧光，但在液池中、后部分的荧光体，则因入射光强度大大减弱而使所产生的荧光强度大大下降。因而在检测器窗口所探测到的荧光强度反而更低。 在浓度较高的溶液中，可能发生溶质与溶质间的相互作用，产生荧光物质的激发态分子与其基态分子的复合物或荧光物质的激发态分子与其它溶质基态分子的复合物，从而导致荧光强度的下降。在浓度更大时，甚至可能产生荧光物质基态分子的聚集体，导致荧光强度更严重的下降。 假如荧光物质的吸收光谱与它的荧光光谱呈现重叠，便可能发生所发射的荧光被部分再吸收的现象，从而造成荧光强度下降。在这种情况下，浓度增大时会促使再吸收现象的加剧。 二、Varian Cary Eclipse 荧光 分光光度计的特点 由于荧光物质的荧光强度与 激发光源的强度成正比，Eclipse采用了无须预热、耗能12 W 但脉冲输出能量却高达75 KW 的闪烁氙（Xe）灯，并利用电子技术控制,使其仅在发出测量指令后才闪烁。这一设计给荧光分析者带来极大的方便. 由于荧光分析测量的是分子的绝对发光强度，背景荧光和散射光的干扰越低，灵敏度就越高。Eclipse为有效克服这些干扰，在其激发和发射单色器上都配置了多波长范围的滤光片，一旦选定测量波长，软件可自动调用合适的滤光片。 一支用于样品信号的测量，一支用于参比信号。这种红敏的光电倍增管在紫外至红外1100nm的波长范围内都具有良好的灵敏度，同时还可以通过软件调整光电倍增管检测电压（强荧光测量用低电压，弱荧光用高电压），在保证合理灵敏度的同时，最大限度地延长其使用寿命，与长寿命光源相匹配，共同确保Eclipse的整机使用寿命。 减少了测量所需的样品体积（标准10mm液池仅需0.5 mL样品）。同等条件下，由于检测到的样品体积比垂直狭缝大得多，因此，Eclipse的灵敏度比传统垂直狭缝设计高出5 ~ 30倍。 在指定所用溶剂后，Eclipse的预扫描功能可自动识别出该溶剂的拉曼、瑞利以及二级散射峰，并在扫描结束后自动给出最佳的激发/发射波长，方便初学者确定多吸收/发射带化合物的荧光测量参数。除激发、发射和同步扫描外，Eclipse还具备固定波长间隔（0.15－30nm）和三维谱图的扫描功能，以获取最佳的分辨率和最丰富的光谱信息，并具备对扫描结果进行加、减、1-4阶导数等的运算功能。尤其方便的是扫描结果可以加上图注后直接插入到Word文件中，方便文章发表。 操作者仅需准备标准溶液和样品，数据的读取、工作曲线、回归方程、相关系数等的运算都由Eclipse 自动完成，并生成标准报告。 用户可根据所遵守规范的要求随时对诸如杂散光水平、波长准确性、灵敏度等多达17项性能指标进行检验，随时了解仪器的状态。 三、 Varian Cary Eclipse 荧光分光光度计使用方法 1.扫描测量 2.浓度测量 3.动力学测量 4.仪器性能认证 一、 Varian Cary Eclipse 荧光分光光度计测定物质浓度的一般步骤（标准曲线法）： 1、仪器参数设定 2、制作工作曲线 3、测定待测液浓度 二、本实验的一些要求 1、本实验4人1组，每组配制1 套标准溶液 和1个待测液。 2、玻璃仪器清洗洁净。 3、准确使用吸量管、正确使用石英比色皿。 4、用坐标纸认真绘制工作（标准）曲线。 计算工 作曲线的斜率、截距，确定回归 方程。 5、计算待测液浓度及药片中维生素B2含量，每人单独完成实验报告。 第10步： a. 点击自动保存(Auto store)，进