DNA质量与浓度的琼脂糖凝胶电泳法测定试验原理.PPT

实验二.DNA浓度与纯度的测定 （一）DNA浓度的分光光度计测定 实验原理： 核酸的紫外吸收 碱基含有共轭双键，使相关化合物在240-290 nm的紫外波段有强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm左右 OD260的应用： 1. DNA或RNA的定量: OD260= 1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml单链寡聚核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 含杂蛋白及苯酚， OD260/OD280降低 注意事项： 1.为防止读数漂移： 选用TE缓冲液为溶剂（PH一定，离子强度低） 合适的稀释浓度，保证吸光值在0.1-1.5范围内 混合要均匀，无气泡和悬浮物，视窗干净 2.紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25 ?g/mL的核酸溶液。 操作步骤： 以TE缓冲液为空白对照； 将基因组DNA溶液分别用TE缓冲液稀释50倍、80倍、100倍至4ml，分别测OD260和OD280 ； 基因组DNA浓度为： OD260 ×核酸稀释倍数×50（μg/mL）；样品各稀释级别算得的浓度平均值，即作为该样品的实际DNA浓度。 以OD260/OD280初步判断提取基因组DNA的纯度。 （二）DNA质量与浓度的琼脂糖 凝胶电泳法测定 实验原理： Ⅰ. pHDNA PI，DNA带负电荷，阴极→阳极 Ⅱ. DNA在琼脂糖凝胶中的迁移率取决于： 1. DNA分子的大小 DNA迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比. 2. 琼脂糖浓度 浓度越大，DNA迁移率越低 3. DNA的构象 超螺旋环状线状 开环状 4.凝胶中、电泳缓冲液中的溴化乙锭 降低DNA的迁移率 5.电压： 低电压时，迁移率与电压成正比 适宜电压：5-8V/cm 6.电泳缓冲液： 离子强度适中 主要：TAE, TBE，TPE PH 7.5-7.8 操作步骤 琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶 样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝 加样：加样端为负极（黑） 电泳：5V/cm 观察：紫外灯下观察，照相 准备胶槽 溶 胶 凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml 铺 胶 凝胶凝固后取出梳子 加缓冲液 准备样品 凝胶上样缓冲液（6×） 蔗 糖 　　 40％ 溴酚蓝 　　 0.25％ （迁移率≈300bp双链DNA） 点 样 电 泳 注意观察溴酚蓝染液的迁移 紫外灯下观察电泳结果 照 相 * TAE TBE和TPE 缓冲容量 低 高 成 本 低 稍高 DNA迁移率 快 慢 高分子量的 DNA分辨率 低分子量的 DNA分辨率 不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围 琼脂糖浓度（%） 分离范围（kb） 0.5 0.7-25 0.8 0.5-15 1.0 0.25-12 1.2 0.15-6 1.5 0.08-4 *