双重消化和结扎.ppt

5组：李东 老师：陈思;目录;DNA的限制性酶切实验原理;根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。;限制性内切酶的类型; 第二类（III型）限制性内切酶：也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。;第三类（Ⅱ型）限制性内切酶：就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。;粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G|AATTC ……3’ 3’…… CTTAA|G …… 5’ 在双链上交错切割的位置切割后生成 5’……G AATTC……3’ 3’……CTTAA G……5’ 各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。;II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT|ATC …… 3’ 3’…… CTA|TAG …… 5’ 　 切割后形成 5’…… GAT ATC …… 3’ 3’…… CTA TAG …… 5’ 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。;用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜体字。 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。;实验材???及仪器 ; 双酶切;结果;结果与分析 ;１．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。;连接反应;连接体系; ; ;顺钙垫裤痛废术朱经脏购钻绒鬼具昭胖铡抑迄守焰伯锹福罐愉橙改贤弥京双重消化和结扎双重消化和结扎