研究生实验课.ppt

Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少 PCR反应条件的选择 PCR反应条件: 温度 时间 循环次数 温度与时间的设置： 设置变性-退火-延伸三个温度点 标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸 对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸 ① 变性温度与时间： 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因 一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性 若低于93℃则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败 ② 退火(复性)温度与时间： 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想 引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T） 复性温度=Tm值-（5-10℃） 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 复性时间一般为30～60s，足以使引物与模板之间完全结合 ③ 延伸温度与时间： Taq DNA聚合酶的生物学活性： 70-80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时，DNA合成几乎不能进行 ③ 延伸温度与时间： 延伸温度：一般选择在70-75℃之间 常用温度为72℃ 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 3-4kb的靶序列需3-4min 扩增10Kb需延伸至15min 延伸进间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些 循环次数 循环次数 决定PCR扩增程度 循环次数 主要取决于模板DNA的浓度 循环次数：选在30-40次之间 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多 PCR反应特点 特异性强 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低 1.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 并混匀：(每份17.75 μL ) Mgcl 1.6 μL 20.8 μL 10 X 缓冲液 2.0 μL 26 μL dNTP 0.4 μL 5.2 μL 引物1 0.8 μL 10.4 μL 引物2 0.8μL 10.4 μL DNA模板 2.0 μL Taq DNA聚合酶 0.25 μL 无菌蒸馏水补至 20 μL 157.95 μL 操作步骤 PCR技术的基本过程 模板DNA dNTP 引物 Buffer 预变性 模板DNA dNTP 引物 Buffer TaqDNA聚合酶 94oC5min’ 基本过程 PCR技术的基本过程 预变性， 94℃ 5min 变性， 94℃ 30s 复性， 54 ℃ 30s 延伸， 72 ℃ 1min 最后一次延伸，72 ℃ 7 min 保存 ， 4 ℃ 反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀,上样电泳。 操作步骤 琼脂糖凝胶电泳 质粒DNA提取的