黑斑蛙Dmrt1及Sox9基因cDNA序列的克隆研究及其精巢组织cDNA文库的构建.pdf

黑斑蛙Dmrt1 和 Sox9 基因 cDNA 序列的克隆研究 及其精巢组织 cDNA 文库的构建 摘 要 性别是一个高度保守的性状，但是不同进化地位的物种控制性别发育的分 子机制却不尽相同。哺乳类中有雄性性别决定因子Sry基因(Sex-determining region of Y chromosome, Sry) ，而在非哺乳类的脊椎动物中却缺少Sry基因。因 此，研究非哺乳类动物的性别决定和分化相关基因具有重要意义。黑斑蛙是两 栖动物，分布广泛，是研究性别发育分子遗传机制的良好模式动物。 Dmrt1和Sox9基因分别是Dmrt(Double-sex and Mab-3 related transcription factor)和Sox(SRY related HMG-box gene)基因家族的成员。作为参与发育的基因 家族，这两个家族在系统进化上高度保守，在胚胎发育分化、组织器官的形成 及相关功能的维持、性别决定和分化等中都具有重要的作用。Dmrt1主要表达 于脊椎动物成体的精巢中，在所有脊椎动物中对诱导精巢的正常发育起着至关 重要的作用。Sox9基因高度保守，参与性别决定，诱导足细胞的发育，而且还 参与骨、神经系统和心血管的发育。 为进一步研究Dmrt1 基因和 Sox9 基因，本文采用 SMART 技术(switching mechanism at 5’ end of RNA transcript)获得了黑斑蛙精巢组织双链 cDNA 。用 RACE(Rapid amplification of cDNA ends, RACE) 和 RT-PCR(Reverse transcription PCR, RT-PCR) 的方法克隆了Dmrt1 基因的全长 cDNA 及Sox9 基因 的cDNA 序列。经过拼接后获得的 Dmrt1 序列为全长 cDNA，由 1807 个核苷 酸组成，其开放阅读框 ORF 包含 1005bp，能编码 334 个氨基酸；5’UTR(非翻 译区)为 87bp，3’UTR 为 712bp 。通过 BLAST 与 Genbank 上的已知序列进行 相似性检索，本文获得的黑斑蛙 Dmrt1 核苷酸序列与粗皮蛙(Rana rugosa)、非 洲爪蟾(Xenopus laevis ) 、人(Homo sapiens) 、鼠(Mus musculus)分别具有 93 ％、 71 ％、66 ％、66 ％相似性，其推导的氨基酸序列与上述物种具有93 ％、77 ％、 76 ％、76 ％的同源性。通过RT-PCR 技术获得黑斑蛙 Sox9 基因的 cDNA 序列 由 1448 个核苷酸组成，其开放阅读框 ORF 含有 1446bp，能编码 481 个氨基 酸。通过 BLAST 与 Genbank 上的已知序列进行相似性检索比对，发现黑斑蛙 Sox9 序列与其他物种具有较高的相似性，其核苷酸序列与粗皮蛙，中华大蟾 蜍(Bufo bufo gargarizans) 、西方爪蟾(Xenopus tropicalis ) 、非洲爪蟾、密西西比 鳄(Alligator mississippiensis) 、人、鼠、鸡(Gallus gallus)分别具有 94 ％、87 ％、 83 ％、82 ％、81 ％、81 ％、80 ％、79 ％的相似性，推导的氨基酸序列与上述物 种的一致性分别为 96 ％、93 ％、91 ％、90 ％、85 ％、80 ％、81 ％、84 ％。ClustalX 比对结果也显示这两个基因在动物系统进化上具有较高的保守性。本文研究结 果显示，黑斑蛙Dmrt1 和 Sox9 基因在成体黑斑蛙精巢组织中表达。 另外，本文还构建了黑斑蛙精巢组织的cDNA文库。经检测原始文库的滴 度分别为2.0×106 pfu/mL 和2.4×106 pfu/mL ，扩增后的文库滴度为0.48×109 pfu/mL 和3.0×109 pfu/mL ，重组率均在90 ％以上。其插入片段平均长度约为 1.0kb。挑取一阳性克隆分别从5’端和3’端进行测序, 得到一长为1170bp的序 列。经序列分析知，该序列含有完整的编码框,可编码305个氨基酸，是一全长 cDNA序列，提示所建文库是可以用于全长cDNA 的筛选。本文所构建的黑斑 蛙精巢组织cDNA文库的各项指标均满足建库的基