济南市艾滋病检测新技术与生物安全管理培训报告.doc

济南市艾滋病检测新技术与生物安全管理培训报告 10月26日，2012年度全市艾滋病检测技术与生物安全管理培训班在市疾控中心举办培训班邀请国家疾控中心艾滋病参比实验室邢文革教授就“艾滋病检测技术进展及质量控制”进行了授课市疾控中心讲授了艾滋病筛查实验室职业暴露与生物安全防护等知识。 ELISA基本原理：是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂的方法，是标记免疫技术的一种。免疫技术是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即应用制备好的特异性抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。 特点是具有高度的特异性和敏感性。将抗原或抗体用可以微量检测的标记物(例如放射性核素、荧光素、酶等)进行标记，则在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的敏感性。 标记免疫技术一般分为两类。一类用于组织切片或其他标本中抗原或抗体的定位属于免疫组化技术。另一类用于液体标本中抗原或抗体的测定。称为免疫检测。 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：① 固相的抗原或抗体，② 酶标记的抗原或抗体，③ 酶作用的底物，根据试剂的来源和标本的性状以及检测的条件，可设计出各种不同的检测方法。 双抗体夹心法：最常用的方法，操作步骤如下： (1)将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质（在商品化的试剂盒中，已经完成此步骤）。 (2)加受检标本，使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与同相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 (3)加酶标抗体，使固相抗原复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 (4)加底物：酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 双抗原夹心法： 根据双抗体夹心法的原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可双抗原夹心法测定标本中的抗体。（HIV试剂多属于此种类型） ELISA试剂盒的组成：ELISA的成品试剂盒中包含以下各组分： (1)已包被抗原或抗体的固相载体(96孔板); (2)酶标记的抗原或抗体(结合物) (3)酶的底物（缓冲液和底物液或称A/B液） (4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中) (5)有些试剂盒中还有标本的稀释液 (6)洗涤液（基本为通用的浓缩磷酸盐溶液） (7)酶反应终止液（一般为弱硫酸液） ELISA试剂盒的选择：必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、批批检验合格、在有效期内的试剂。推荐使用经临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。 ELISA方法模式图 ELISA检测需注意的问题：操作环境、环境温度、仪器的校准、洗板机的维护、比色波长的设定、Cutoff值计算。 ELISA试验的假阳性反应： a.溶血样本：溶血标本可能会增加非特异性显色。 b.CMV、EBV、红斑狼疮、风湿病患者：自身抗体与HIV-1的某些抗原决定簇有交叉反应性，在初筛检测时可能导致假阳性现象。 c.新生儿:20%～60%的婴儿受到HIV感染,因为母体HIV抗体可持续大约15个月之久, d.技术误差 e.细菌污染：菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。 f.抗凝：抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性. g.辣根过氧化物酶：国产 ELISA试剂一般都用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)制备结合物。HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增 加非特异性显色。 2．HIV的筛查及确证检测 艾滋病筛查实验室的职能： a.对收到的血液样品进行艾滋病筛查检测，并及时妥善进行原始资料的登记及管理工作。 b.对HIV抗体不确定标本进行追踪。 c.及时通过网络进行“月报告”；济南市要求5日之前上报。 e.接受上一级艾滋病实验室的业务考核和现场督导。 d.接受患者关于HIV知识的咨询解释工作。（对HIV检测所涉及内容要贯彻保密原则） HIV筛查实验室检测要求： a.方法是使用ELISA(第三代/第四代)、化学发光等技术规范准许的检测方法; b.不能只用快速检测作为初筛实验。 c.无论何种实验，必须留有原始检测记录，包括快速检测也必须留存检测记录。 d.对于初筛阳性的样品，需要再进行2次筛查检测，其中至少一次检测要使用不同厂家或不同方法进行。 艾滋病筛查实验室阳性标本的处理: a.对于再次检测后，其中任一种方法呈现阳性反应的标本，应在24小时内上送“艾滋病确证实验室”。