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天津医药2015年7月第43卷第7期 717 miR-223敲减慢病毒的构建 张欣,关晓慧,王宝利△ 摘要：目的 构建miR-223敲减慢病毒，为进一步研究miR-223 的功能提供工具。方法 采用Invitrogen公司 miR-RNAi在线设计工具，根据miR-223成熟体序列设计了一对互补寡核苷酸片段,退火产物连接至pcDNA6.2- GW/EmGFP-miR载体，经酶切连入pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体，构建了miR-223敲减慢病毒质粒，利用 293T细胞将其包装成病毒，并感染ST2细胞，观察感染效率并用qRT-PCR检测miR-223成熟体表达。结果 酶切 鉴定及测序结果显示成功构建了miR-223敲减慢病毒载体，miR-223敲减慢病毒包装并感染靶细胞，表达绿色GFP 9 荧光蛋白的细胞约占细胞总数的80%~90%，病毒滴度为 1×10 PFU/mL，感染效率达90%。感染miR-223敲减慢病 毒的细胞miR-223表达量（0.31±0.03）低于阴性对照（1.00±0.09），为阴性对照的31%，差异有统计学意义（n=3，t= 15.091，P＜0.05）。结论 成功构建了miR-223敲减慢病毒，为进一步研究miR-223的功能准备了条件。 关键词：微RNAs；慢病毒属；RNA干扰；慢病毒源性载体；miR-223 中图分类号：Q524.6 文献标志码：A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.004 EstablishmentofmiR-223knockdownlentivirus ZHANGXin,GUANXiaohui,WANGBaoli△ KeyLaboratoryofHormonesandDevelopment(MinistryofHealth),MetabolicDiseasesHospitalInstituteofEndocrinology, TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China △CorrespondingAuthor E-mail：bliwang72@163.com Abstract: Objective ToconstructmiR-223 knockdownlentivirusvectorandprovideatoolforfurtherstudyofthe functionofmiR-223.Methods AccordingtotheInvitrogenmiR-RNAionlinedesigntool,apairofcomplementaryoligo⁃ nucleotidesencodingmiR-223maturesequencewasdesigned,annealedandligatedwithpcDNA6.2-GW/EmGFP-miRvec⁃ tor.ThenmiR-RNAiexpressioncassettewascutandsubclonedintolentiviralpCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPvector.The lentiviruseswerepackagedandtitered,andthenST2cellswereinfectedwithviruses.Theefficiencyofinfectionwascalcu⁃ lated,andtheknockdownofendogenousmiR-