CXCR4-SDF1对乳腺癌细胞MCF7增殖作用的影响.doc

　　CXCR4/SDF1对乳腺癌细胞MCF7增殖作用的影响 【关键词】 CXC趋化因子受体4 基质细胞衍生因子 MCF7细胞 CXCR4单克隆抗体 增殖 　　0引言 　　近年研究表明，肿瘤细胞可以表达某些趋化因子（chemokines）或趋化因子受体，并且趋化因子及其受体可能通过与炎症细胞浸润相似的机制参与肿瘤细胞的发生、发展与侵袭转移过程［1-2］. CXC趋化因子受体4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）与其配体-趋化因子CXCL12，即基质细胞衍生因子1（stromal cellderived factor1, SDF1）相互作用构成一个细胞信息传递的生物学轴（biological axis），决定着肿瘤细胞的生长与转移过程［3］. 目前，肺癌、卵巢癌、乳腺癌、白血病等众多肿瘤细胞中均发现有CXCR4的高表达，并且CXCR4已成为肿瘤诊断与治疗的新靶点，越来越多受到人们的重视［4］. 已有研究表明，CXCR4/SDF1生物学轴不仅对乳腺癌细胞的转移起关键作用［3］，而且与乳腺癌细胞的生长也有着密切的联系［5-6］. 我们以乳腺癌细胞系MCF7为研究对象，采用CXCR4 mAb进行体外实验性干预，观察MCF7细胞的生长能力及细胞增殖相关蛋白的变化，以阐明CXCR4/SDF1生物学轴对乳腺癌细胞增殖的影响. 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　人乳腺癌细胞系MCF7由第四军医大学航空航天医学系谢满江博士惠赠；CXCR4 mAb（IgG2b 44717.111 clone)购于美国Sigma公司；噻唑蓝（tetrazoliumblue，MTT）、碘化丙啶（propidium iodide, PI）为美国Sigma公司产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗、羊抗鼠FITCHRP抗体与鼠抗人增殖细胞核抗原（proliferating cell nucleus antigen, PA）抗体购于北京华美公司. MCF7细胞用RPMI 1640（含100 mL/L胎牛血清）在37℃， 50 mL/L CO2孵箱中常规培养. 　　1.2方法 　　1.2.1MCF7细胞CXCR4蛋白的表达取对数生长期的MCF7细胞，加入RIPA (RadioImmunoprecipitation Assay，美国Pierce)裂解液. 冰上静置10 min后，以4℃，10 000 r/min离心5 min后取上清. 采用BCA法（BCA protein assay reagent kit，美国Pierce）进行蛋白定量后，蛋白样品加入等体积的2×SDS凝胶上样缓冲液混匀，置于沸水浴中加热10 min. 蛋白样品（每孔上样量均为20 μg总蛋白）以80 mg/L SDS聚丙烯酰胺凝胶（Novex, San Diego, 美国CA）进行电泳分离，分离的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜（hybondECL membrane, 美国Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, IL）上. 4℃以含100 g/L脱脂奶粉的TBST封闭过夜后，加入用封闭液稀释的CXCR4 mAb（1∶1000）室温孵育1 h；以TBST洗膜3×10 min；以TBS稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗（1∶5000），室温孵育1 h后，以TBS洗10 min×2. 最后用增强的化学发光反应混合液（enhanced chemiluminescence，ECL，美国Pierce）显色，感光胶片（hyperfilm ECL, 美国Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, IL）曝光. 　　1.2.2MCF7细胞生长能力取对数生长期的MCF7细胞以2.5 g/L胰酶消化，再以5×106/L的细胞密度接种于96孔板. 37℃，50 mL/L CO2条件下培养过夜后，加入含有50 mg/L CXCR4 mAb的培养液（根据预实验结果，选取50 mg/L作为实验浓度)，空白对照组加相应体积的培养液. MCF7细胞分别培养24，48，72，96 h后，加入终浓度为5 mg/L的MTT 10 μL，继续培养4 h后吸取培养液，每孔加入DMSO 150 μL溶解结晶，充分振荡15 min，用酶联免疫检测仪测定各孔490 nm吸光度值（A490）. 绘制各组生长曲线并计算细胞存活率. 细胞存活率＝实验组各孔平均A490值/相应对照孔平均A490×100％. 另取对数生长期的MCF7细胞以2.5 g/L胰酶消化，再以400个/孔的细胞密度接种于已制备好琼脂培养基的6孔板中. 培养过夜后，以50 mg/L CXCR4 mAb作用48