Cyclopamine联合YH16对人胰腺癌BxPC3细胞的抑制作用.doc

　　Cyclopamine联合YH16对人胰腺癌BxPC3细胞的抑制作用 ：徐复国，马清涌，郭坤，胡恒通，张珉，沙焕臣，宫晓光 【摘要】 目的 体外研究Hedgehog(HH)信号通路阻断剂Cyclopamine和抗血管生成剂YH16对胰腺癌细胞株BxPC3的抑制作用。方法 以Cyclopamine和YH16单独或联合干预BxPC3细胞，MTT法观察药物对肿瘤细胞生长的影响，流式细胞仪检测细胞凋亡，RTPCR法检测细胞凋亡相关蛋白Bcl2和Bax的表达情况。结果 Cyclopamine和YH16对BxPC3细胞均有明显的抑制作用，两者联合作用时抑制作用更强(Plt;0.05)。Cyclopamine和YH16均可诱导细胞凋亡，联合作用后细胞的凋亡率更高(Plt;0.05)。Cyclopamine和YH16均可下调Bcl2和上调Bax的表达，联合用药则下调Bcl2和上调Bax更明显(Plt;0.05)。结论 Cyclopamine和YH16能抑制BxPC3肿瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡，两者联合作用时抑瘤效果明显增加，其机制可能与调控凋亡相关蛋白Bcl2、Bax的表达有关。 【关键词】 Cyclopamine;YH16;胰腺癌;细胞增殖;细胞凋亡 ABSTRACT:Objective To explore the inhibitory effect of Hedgehog signal pathine bined an pancreatic cancer cell line BxPC3 in vitro. Methods BxPC3 cells ine, YH16 or a bination of the tined by AnnexinV/PI floetry. oreover, cycloppamine bined ight be related to the regulation of apoptosisrelated proteins Bcl2 and Bax. 　　KEY I1640培养基(含双抗)、2.5g/L胰蛋白酶(含EDTA)购自 GIBCO公司，AnnexinV/PI凋亡试剂盒购自CALTAC公司，Bcl2、Bax引物购自北京三博远志生物技术公司，RevertVidTM cDNA逆转录试剂盒购自FERMENTAS公司，2×Taq PCR MasterMix购自TIANGEN BIOTECH 公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 胰腺癌细胞系BxPC3用含100mL/L新生小牛血清的RPMI1640培养液，在37℃、50mL/L CO2和一定湿度的培养箱中体外孵育，培养液中含青霉素100IU/mL、链霉素100mg/mL，细胞生长达汇合状态时，2.5g/L胰蛋白酶消化后传代。全部实验均采用指数生长期细胞，实验重复3遍。 　　1.2.2 MTT法检测细胞的生长情况 将对数生长期BxPC3细胞以5×103/mL密度接种于96孔培养板(Corning, NY 14831, USA)上，每孔200μL，每组设4个平行孔;将培养板放入CO2孵箱，在37℃、50mL/L CO2及饱和湿度条件下培养过夜，细胞贴壁后单用Cyclopamine (0.625、1.25、2.5μmol/L)、YH16(10、20、30μg/mL)及 联合Cyclopamine(1.25μmol/L)和YH16(10、20、30μg/mL)干预细胞，分别培养24、48、72h;每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，37℃继续培养5h，终止培养;小心吸弃孔内培养的上清液，每孔加入150μL DMSO，震荡10min使甲襸充分溶解;选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值(A)，记录结果。细胞生长抑制率(%)=(1-实验组A/空白对照组A)×100%。 　　1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集不同处理组细胞，PBS洗2次，调整细胞密度为5×106/mL，取100μL细胞悬液加入20μL Annexin ⅤFITC和5μL碘化丙锭(PI)，混匀，于暗室处孵育15min，上流式细胞仪检测。 　　1.2.4 RTPCR检测药物对Bcl2和Bax mRNA表达的影响 用Trizol试剂提取Cyclopamine和YH16干预BxPC3细胞后的总RNA，测定260/280nm的A值， 计算 RNA浓度。Bcl2的上游引物：5′CGAGTGGGATGCGGGAGATG3′,下游引物：5′CGGGATGCGGCTGGATGG3′;Bax的上游引物：5′ TCAGGATGCGTCCACCAAGAAG3′，下游引物：5′TGTGTCC