sIL15Rα与脾细胞孵育后对小鼠黑色素瘤细胞生长的免疫调节作用.doc

　　sIL15Rα与脾细胞孵育后对小鼠黑色素瘤细胞生长的免疫调节作用 ：顾艳宏, 王榕生, 束永前, 徐强 【摘要】 目的: 研究可溶性IL15Rα与脾细胞共同孵育后对小鼠黑色素瘤细胞生长的免疫调节作用。方法: 制备小鼠脾细胞, 分成两组, 一组加入可溶性重组IL15Rα (sIL15Rα), 另外一组不加, 培养48 h后, 分离两组的贴壁细胞和非贴壁细胞, 流式细胞术(FCM)分析CD4、 CD8、 B220、 CD11c、 CD1a的表达; 并把上述4组细胞（即脾细胞非贴壁细胞组, 脾细胞贴壁细胞组, 脾细胞+sIL15Rα非贴壁细胞组, 脾细胞+sIL15Rα贴壁细胞组）和黑色素瘤细胞一起分别注射到小鼠腹部皮下, 观察小鼠腹部皮下肿瘤生长抑制情况, 对照组只注射小鼠黑色素瘤细胞。结果: 脾细胞+sIL15Rα贴壁细胞组小鼠黑色素瘤的生长速度显著小于其他各组; FCM分析, 此组细胞主要成分可能为树突状细胞（DC）。 结论: sIL15Rα与脾细胞共同孵育后, 可能通过DC的作用, 对黑色素瘤的生长进行免疫调节, 从而抑制瘤细胞的生长。 【关键词】 sIL15Rα; IL15; 树突细胞; 黑色素瘤 IL15 属于IL2家族, 它与IL2共用β和γ受体进行信号传导, 但同时又拥有自己独特的α受体, 是与IL2功能有所不同的一种T 细胞生长因子［1］。在生理条件下, IL15与膜上的IL15Rα结合, 但一般认为, 只有在出现IL2/15Rβ和γc时, 才能进行信号传导［2］。IL15Rα分布广泛, 在很多组织和细胞都能被检测出来, 例如脑、 肠、 肝、 外周血单核细胞（PBMC）等。它在体内以两种形式存在, 一种是膜型, 一种是可溶型, 可通过自分泌、 内分泌、 旁分泌或近分泌形式作用于靶器官和组织。其中, 可溶型的IL15Rα（sIL15Rα）相对分子质量（Mr）为42 000, 在生理条件下, 很低的浓度（pmol/L）就能与IL15有很高的亲和力。现在认为, 这种sIL15Rα是锚在膜上的IL15Rα通过金属蛋白酶水解后脱落的, 它可以阻断IL15与细胞膜表面受体的连接, 抑制IL15的作用。因为sIL15Rα对IL15有高亲和力, 有假说认为, sIL15Rα可能扮演一种类似分子清洗物的作用来去除多余的IL15; 当然, 它们之间的这种高亲和力的结合也许还起到其他作用, 目前仍不清楚［3, 4］。本实验中, 我们把sIL15Rα与脾脏细胞共同孵育后, 进一步研究其对小鼠黑色素瘤生长的影响。1 材料和方法 1.1 材料 6～8周龄的雄性C57BL/6小鼠, 质量22～25 g购自扬州大学实验动物中心。饲养温度为25℃左右, 光照周期为光照12 h, 黑暗12 h（12L: 12D）, 自由采食、 饮水。小鼠黑色素瘤细胞（B16）为本实验室长期拥有, 培养于RPMI1640培养液中, 含100 mL/L新生小牛血清, 10万U/L的青霉素/链霉素(INVITROGEN)。CD4、 CD8、 B220、 CD1a、 CD11c单克隆抗体（mAb）均购自美国BD公司。小鼠IL15、 IL2、 IFNγ ELISA试剂盒购自RD 公司。可溶性重组IL15Rα/Fc嵌和体(sIL15Rα) 购自RD 公司。 1.2 方法 1.2.1 小鼠脾细胞的制备 拉颈椎处死小鼠, 无菌条件下取出脾脏, 放入盛有 RPMI1640完全培养液的平皿中, 研磨, 过滤, 获得粗制的脾细胞悬液; 4℃低速离心1 000 r/min, 5～10 min, 弃上清, 重悬细胞, 加入预冷TrisNH4Cl红细胞裂解液1 mL, 轻轻吹打混匀, 室温静置1～2 min, 溶解红细胞; 加5 mL RPMI1640完全培养液终止反应, Hank’s液洗2次, 最后将沉淀细胞重悬于2 mL RPMI1640完全培养液中; 细胞计数及测定存活率。 1.2.2 FCM检测 把上述制备的小鼠脾细胞, 分成两组, 一组加入可溶性重组IL15Rα(sIL15Rα), 另外一组不加, 培养48 h后, 分离两组的贴壁细胞和非贴壁细胞, 用FCM分析其组分。即把上述4组细胞: 脾细胞非贴壁细胞组（SC NA）, 脾细胞贴壁细胞组（SC AD）, 脾细胞加入IL15Rα非贴壁细胞组（SC+sIL15Rα NA）, 脾细胞加入IL15Rα贴壁细胞组（SC+sIL15Rα AD）, 分别用PBS洗涤2次, 将细胞重悬于PBS中, 加入抗CD4PE、 CD8PE、 CD11cPE、 CD1a、 B220PE。充分混匀, 置4℃黑暗中孵育30 min, PBS洗涤2