β肾上腺素能受体阻断剂诱导胰腺癌细胞株PC2凋亡的实验研究.doc

　　β肾上腺素能受体阻断剂诱导胰腺癌细胞株PC2凋亡的实验研究 ：张东，马清涌，沙焕臣，胡恒通，郭坤 【摘要】 目的 观察β肾上腺素能受体阻断剂是否通过诱导胰腺癌细胞凋亡而产生抑制效应。方法 利用特异性β1肾上腺素能受体阻断剂美托洛尔、广谱β肾上腺素能受体阻断剂普萘洛尔、特异性β2肾上腺素能受体阻断剂丁氧胺干预诱导人胰腺癌PC2细胞。RTPCR和 assay. The expressions of Caspase3, Caspase9 and Caspase8 RNA and protein for both of β1 and β2adrenoceptors. The Hoechst staining, TUNEL and FCM assay shober of apoptotic cells; TUNEL assay indicated that the rate of apoptosis ine (15.4±1.99)% folloetoprolol (7.62±1.46)%. FCM assay shoine (16.2±1.58)%, folloetoprolol (6.29±1.77)%. βadrenoceptor antagonist therapy affected Caspase3 and Caspase9 fragment expression, but not Caspase8. Conclusion It is suggested that βadrenoceptor antagonists induce apoptosis of PC2 cells through inhibiting β2adrenergic receptor mainly. 　　KEY APKs)和cAMP/PKA通路，从而促使胰腺癌细胞的增殖[3]。本课题组旨在通过β受体阻滞剂抑制对胰腺癌细胞的诱导，研究胰腺癌细胞的凋亡情况。 　 　1 材料与方法 　　1.1 材料 DMEM培养基和胎牛血清购自GIBCO公司;TUNEL试剂盒购自Roche Diagnostic公司;β受体阻断剂美托洛尔、普萘洛尔和丁氧胺购自Sigma Chemical公司;MTT试剂和Hoechst 33342试剂购自Sigma Chemical公司;反转录试剂盒购自Fermentas Life Science公司;β1和β2单克隆抗体，Caspase3，Caspase9和Caspase8单克隆抗体购自Abcam公司。 　　1.2 胰腺癌细胞株PC2的培养 人胰腺导管上皮腺癌细胞株PC2购自 中国 协和医科大学，BxPC3细胞购自美国ATCC公司。使用DMEM高糖培养基和100mL/L胎牛血清的全培养基培养细胞，将细胞于37℃、50mL/L CO2培养箱中常规培养。 　　1.3 RTPCR鉴定受体mRNA的表达 用Trizol法提取PC2和BxPC3细胞的总RNA。引物设计：β1AR上游引物：5′GGGAGAAGCATTAGGAGGG3′，下游引物：5′CAAGGAAAGCAGGTGGG3′，扩增片段270bp;β2AR上游引物：5′CAGCAAAGGGACGAGGTG3′，下游引物：5′AAGTAATGGCAA AGTAGCG3′，扩增片段334bp。逆转录后，进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃变性1min，62℃退火1min，70℃延伸2min，循环35次。琼脂糖凝胶电泳检测。 　　1.4 细胞增殖实验 利用MTT法检测细胞增殖。于96孔培养板内接种1×104个对数生长期的细胞,细胞生长于全培养基中，于37℃、50mL/L CO2培养箱中培养。24h后分别加入不同浓度的肾上腺素、普萘洛尔和5氟尿嘧啶，24h后每孔加入MTT试剂20μL，4h后弃去上清液，每孔加入150μL DMSO，10min后利用酶标仪进行检测。 　　1.5 细胞凋亡的检测 　　1.5.1 Hoechst 33342荧光染色法 将多聚甲醛处理过的盖玻片置24孔板中，然后将5×104个对数生长期的细胞接种于24孔培养板内，细胞生长于全培养基中，培养于37℃、50mL/L CO2培养箱中。利用100μmol/L普萘洛尔干预细胞24h，用10μg/mL Hoechst 33342染料孵育细胞，4℃过夜，荧光显微镜下观察、计数并照相。 　　1.5.2 TUNEL法 将多聚甲醛处理过的盖玻片置于24孔板中，于24孔培养板内接种5×104个对数生长期的细胞，细胞生长于全培养基中，培养于37℃、50mL/L CO2培养箱中。利用100μmol/L美托洛尔、100μmol/L普萘洛尔和100μmol/L丁氧胺干预细胞24