人NK细胞体外高效扩增的实验研究.doc

　　人NK细胞体外高效扩增的实验研究 ：黄庆生, 李琦, 黄勇, 商澎, 张明杰 【摘要】 　　目的: 建立人NK细胞体外大量扩增的方法。方法: 采用基因工程方法, 在K562细胞上同时表达IL15、 IL18、 41BBL 3种基因, 构建特定的K562工程细胞作为刺激细胞。IL15、 IL18基因分别与一段特殊的跨膜蛋白基因融合, 41BBL直接跨膜表达, 使这3种蛋白在K562细胞中表达后锚定于细胞膜表面。其次, 以照射致死的该K562工程细胞作为刺激细胞, 以人外周血单个核细胞（PBMC）为扩增培养对象, 通过与IL2的共刺激作用, 使NK细胞在体外培养条件下得到大量的扩增。结果: 经过21 d的刺激培养后, CD56+CD3-细胞数量扩增了(520±75)倍。CD56+CD3-细胞的纯度从培养前占PBMC的7%±4%到扩增后占总细胞比例的93%±3%。PBMC中的T细胞基本上没有得到扩增, 扩增后的细胞中CD3+细胞只占2%±1.2%。扩增的细胞具备了NK细胞的基本特征和生物学特性, 除了CD56+CD3-外, 还对扩增的NK细胞上NKG2D、 NKp46、 NKp44、 NKp30、 CD94、 CD158b、 CD158a、 NKB1、 NKAT2等标记进行了验证。细胞毒实验表明, 在效应细胞∶靶细胞为5∶1时, 扩增的NK细胞的杀伤率达到了95%±4%。结论: 建立的NK细胞体外扩增方法, 达到了较高的扩增水平, 且扩增的细胞活性较好。本方法以PBMC为原始材料, 能够实现NK细胞体外的大规模制备, 这将为抗病毒与抗肿瘤的NK细胞免疫 治疗 奠定基础。 【关键词】 扩增; 自然 杀伤细胞; 白细胞介素15; 白细胞介素18; 41BB配体 　　NK细胞（natural killer cell）的过继治疗在抗病毒、 抗肿瘤的治疗中有着广泛的应用前景, 在造血干细胞移植后减少移植物抗宿主反应中的作用也倍受关注［1, 2］。由于NK细胞在外周血中所占的比例很少, 建立一种有效的NK细胞体外扩增系统是深入研究NK细胞功能与探讨NK细胞免疫治疗的基础。体外获取人NK细胞主要有两种途径: 一是采用抗NK细胞特异性抗体与磁珠交联的方法, 从PBMC中分离人NK细胞; 二是采用刺激扩增培养的方法, 从PBMC中扩增培养人NK细胞。前者可以快速获得NK细胞, 但只适用于小规模的NK制备用于研究分析。后者则是以PBMC（或以磁珠分离的NK细胞）为原始材料, 通过特定细胞因子的刺激, 使NK细胞在体外得到特异的扩增［3, 4］, 这种方法是目前被认为比较有应用前景的方法, 通过体外的刺激培养可进行相对大规模的NK细胞制备, 使临床应用成为可能。但是迄今为止多数的体外刺激扩增培养也只能使NK细胞在体外扩增数十到百倍, 且纯度也不理想。在刺激NK细胞生长上, 已知IL2、 IL15、 IL18和IL12等细胞因子在对NK细胞的生长与扩增是非常重要的, 其中IL15的作用尤为重要。除了细胞因子对NK细胞的生长具有促进作用外, 研究人员还注意到K562、 HFC的共同孵育（刺激细胞与NK细胞间的接触刺激）, 经过3周时间的培养, NK细胞得到大量的扩增, 明显高于目前报道的各种扩增方法。我们在上述方法的基础上进行改进, 在K562细胞膜表面表达IL15与41BBL的同时, 将IL18也同时表达在K562细胞的表面, 以该细胞为刺激细胞, 对其在NK细胞扩增中的作用进行了实验研究。 　 　1 材料和方法 　　1.1 材料 PBMC分别来自8个健康献血者（男女各4人）, 其中年龄最大45岁, 最小22岁, 平均38岁。K562细胞、 含CD8α信号肽和穿膜区基因的真核表达载体本室已构建; IL15、 IL18、 41BBL cDNA分别从正常人淋巴细胞中扩增; 抗人CD56、 CD3、 CD94、 NKG2D、 NKp46、 NKp30、 NKp44、 CD158b、 CD158a、 NKB1、 NKAT2特异性抗体购自美国BD Biosciences公司及Coulter公司; NK杀伤活性检测采用日本同仁化学研究所(Dojindo)的Cell Counting kit8试剂盒。RPMI1640为Gibco BRL公司产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 表达IL15、 IL18、 41BBL K562细胞的构建 采用RTPCR方法分别从人PBMC中扩增IL15、 41BBL、 IL18 cDNA, 测序正确后, IL15、 IL18基因分别克隆至CD8α信号肽的下游、 CD8α跨膜区基因的上游。重组的IL15、 IL18、 41BBL再分别亚克隆至含有不同筛选