人细小病毒B19XA株VP1蛋白在Bac　toBac系统中的表达及其反应原性分析.doc

　　人细小病毒B19XA株VP1蛋白在Bac　toBac系统中的表达及其反应原性分析 ：李小青, 张国成, 许东亮, 聂晓晶 【摘要】 　　目的: 探讨人细小病毒B19XA株VP1蛋白在BactoBac杆状病毒表达系统中的表达及其反应原性分析。方法: 以PCR法扩增VP1全长基因, 并将其克隆到pFastBac1载体中, 通过转化E.coli DH10Bac筛选阳性克隆, 抽提重组VP1Bacmid。以VP1Bacmid经Cellfectin介导转染昆虫细胞Sf9, 获取重组杆状病毒, 扩增后感染Sf9细胞表达VP1蛋白, 并以SDSPAGE进行鉴定。以表达的重组VP1蛋白作为抗原, 采用间接ELISA法检测B19病毒感染的患儿血清抗体, 并与德国ELISA试剂盒检测的结果比较, 分析表达产物的反应原性。结果: (1)获得含VP1全长基因的重组杆状病毒, 转染Sf9细胞后能表达相对分子质量（Mr）约87 000的VP1重组蛋白。(2)以表达的重组VP1蛋白作抗原, 与B19病毒感染的患儿血清的反应, 平均A值为0.46, P/N值＞2.1, 与德国ELISA试剂盒检测的结果（平均A值为0.68）相似。结论: 人细小病毒B19XA株VP1蛋白在BactoBac表达系统中可成功表达, 且表达产物能有效地与抗B19病毒的阳性血清反应, 具有良好的反应原性。 【关键词】 人细小病毒B19; VP1基因; 杆状病毒; 蛋白表达; 转染; 反应原性 　　人类细小病毒B19 (human parvovirus B19, HPV B19, 简称为B19 病毒), 是细小病毒属中对人类有致病性的最常见病原体, 与传染性红斑、 儿童风湿性疾病、 再生障碍性贫血危象等多种疾病有关［1］, 对于某些免疫缺陷和免疫抑制的患者, B19 病毒感染甚至是致命的［2］。因此, 建立简单实用、 适于检测 中国 流行株B19 病毒感染的方法, 对该病毒相关疾病的诊断和 治疗 非常重要。本实验借助一种安全、 高效、 表达产物生物活性好的BactoBac杆状病毒表达系统, 选取人细小病毒B19XA株VP1全长基因片段, 构建了重组杆状病毒表达载体VP1Bacmid。以重组质粒转染昆虫细胞Sf9, 诱导重组VP1蛋白的表达, 并以其为抗原, 采用间接ELISA法检测了B19感染患儿血清特异性抗体, 为进一步深入研究B19病毒的分子流行病学、 致病机制及预防疫苗的研制奠定了基础。 　 　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　已构建的人细小病毒B19XA株VP1基因原核表达质粒VP1pET28(a)及E.coli DH5α均由我科实验室保存。限制性内切酶Sal I和Xba I购自美国Promega公司。T4 DNA Ligation Mix、 小量质粒提取试剂盒(TaKaRa)购自大连宝生物工程有限公司。胶回收试剂盒购自上海华舜生物科技有限公司。无内毒素大量高纯度质粒提取纯化试剂盒(Qiagen)购自北京天根生物有限公司。质粒pFastBac1、 E.coli DH10Bac、 Sf9细胞、 Grace’培养液、 Cellfectin Reagent均购自美国Invitrogen公司。Oligo DNA序列均由上海生物工程科技有限公司合成。 　　1.2 方法 　　1.2.1 B19XA VP1全长基因的扩增 　　根据GenBank中人细小病毒B19 DNA序列（GenBank Accession: AF162273）, 经过Primer5 计算 机分析软件自行设计上下游引物各1条, 长度均为25bp, 上游primer: 5′GCGTCGACATGAGTAAAGAAAGTGG3′, 下游primer: 5′GCTCTAGATTACAATGGGTGCACAC3′（划线部分分别为Sal I和Xba I的酶切位点, 斜体为保护性碱基）。以重组质粒VP1pET28(a)为模板, 进行PCR扩增目的基因。反应体系为: 10×PCR buffer(Mg2+ plus) 2μL、2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL、1OD的上下游引物各1μL、DNA模板2μL, 普通rTaq DNA聚合酶2.5 U, 加去离子水至20 μL。反应条件为: 94℃预变性3 min, 进入循环94℃ 60s→55℃90 s→72℃3 min, 共30个循环后, 于72℃再延伸10 min。以去离子水代替DNA模板作为阴性对照。扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。 　　1.2.2 VP1pFastBac1供体质粒的构建与鉴定 　　自琼脂糖凝胶上切下含目的基因片段的凝胶条带, 用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收, 按照说明书操作, 回收体