人骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体的构建.doc

　　人骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体的构建 ：李新友，王金堂，刘淼，王全颖，杨广笑，李萌 【摘要】 目的 为了研究人骨形态发生蛋白7(hBMP7)导入骨缺损模型中的 治疗 作用，构建重组腺病毒载体。方法 将hBMP7基因全长定向克隆入穿梭质粒pACCMVplpA，构建pACCMV/rhBMP7穿梭质粒，应用磷酸钙DNA共沉法将穿梭质粒及包装质粒PJM17共转染293细胞，经细胞内同源重组后，构建骨形态发生蛋白7重组腺病毒Ad pACCMV/rhBMP7。结果 成功构建了重组质粒pACCMV/rhBMP7，经293细胞包装后，扩增纯化测定病毒滴度为1×1011pfu/mL。结论 成功构建人骨形态发生蛋白7重组腺病毒Ad pACCMV/rhBMP7，为骨缺损、骨不连的基因治疗奠定了基础。 【关键词】 骨形态发生蛋白7；腺病毒载体；基因转移；滴度测定 　　ABSTRACT: Objective In order to investigate the treatment of bone defect repairing by rebinant adenovirus transudation the hBMP7 gene, the vector of hPMP7 rebinant Ad id pACCMVplpA. P7 rebinant Ad. The rebinant Ad viral stock id pACCMV/rhBMP7 and packaging plasmid PJM17 by calcium phosphate precipitation. Results The rebinant viral vector of plasmid pACCMV/rhBMP7 L. Conclusion P7 that can serve as the experimental study of gene therapy of bone defect repairing. 　　KEY P)进行基因治疗，为骨缺损、骨不连的修复提供了一条新途径。骨缺损的基因治疗是将BMP等外源性目的基因导入细胞，外源性基因在体内表达功能性蛋白，达到治疗目的。基因治疗的关键是基因转移，高效病毒载体的发展是基因治疗付诸于临床应用的一个重要因素。腺病毒具有安全性好，宿主范围广，容易得到高滴度的重组病毒等优点，使其在基因疫苗及基因治疗的研究中受到人们的青睐，成为当今使用最多的病毒载体之一[1]。腺病毒作为载体进行转基因时，转染细胞的目的基因表达是暂时性高水平表达，这对于骨组织修复特别理想。所以，本研究构建骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体，为骨缺损、骨不连的基因治疗奠定了基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 质粒、菌株、细胞株。pGEMThBNP7 质粒由构建。腺病毒穿梭质粒pACCMVplpA及辅助质粒PJM17和E.coli DH5α由西安华广生物工程公司提供。限制性内切酶(BamHⅠ，Hind Ⅲ)及T4DNA连接酶、胰蛋白酶、蛋白酶K购自西安华美生物工程公司。293工程细胞系由西安华广生物工程公司提供。 　　1.2 实验方法 ①重组质粒pGEMThBMP7 及腺病毒穿梭质粒pACCMVplpA用碱裂解法大量制备。用限制性内切酶BamHⅠ/HindⅢ联合酶切质粒pGEMhBMP7和pACCMVplpA，制备并连接带有相同黏性末端的质粒及全长hBMP7目的基因。②用连接反应产物转化制备好的感受态细菌E.coli DH5α菌株，涂于含IPIG的琼脂板上，挑选单菌落接种于LB培养液中，碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切，筛选出含有1.3ku左右的重组质粒pACCMV/rhBMP7。③将大量制备的pACCMV/rhBMP7和辅助质粒pJM17应用磷酸钙DNA共沉法，转染293细胞。显微镜下见到293细胞表面有细密的沉淀形成。静置4h，去转染液，更换固体培养基，放入孵育箱。10d后，质粒在细胞内同源重组产生出活重组腺病毒，病毒斑出现。继续感染293细胞，扩增病毒。④重组病毒颗粒的回收与纯化。给培养液中加入细胞悬液，反复冻融，透析离心取上清，用蔗糖梯度离心法纯化病毒颗粒。 ⑤病毒滴度测定。取出11个消毒好的试管，取毒种0.2mL，10倍稀释，顺次将毒种稀释至10-11。接种于单层细胞吸附1h后，更换固体培养基，孵育7d后数斑， 计算 滴度。 　　2 结果 　　2.1 重组腺病毒pACCMV/rhBMP7穿梭质粒的构建 5型腺病毒pACCMVplpA穿梭质粒全长8.8ku，用BamHⅠ和HindⅢ两酶联合消化后可获得具有两个黏性末端的开环质粒。pGEMTBMP7质粒全长为4