原核表达的含PTDeGFP不同分子质量融合蛋白穿膜能力的比较.doc

　　原核表达的含PTDeGFP不同分子质量融合蛋白穿膜能力的比较 【关键词】 蛋白转导结构域； 穿膜效率； 增强型绿色荧光蛋白； 分子质量 　　［Abstract］Objective: To judge the efficacy of the fusion protein including protein transduction domain of HIV TAT by multibiotechnology and to obtain the more effective cellular uptake protein for the further research of its biofunction.Methods： The expression of three fusion proteins the inclusion bodies. Floetry analysis and confocal microscope observation embrane and had no difference. 　　［Key ain; the efficacy of transmembrane; prokaryotic expression； green fluorescence protein 　　1988年Green和Frankel分别发现HIV1 TAT蛋白能够穿过细胞膜［1,2］，随后的研究发现，TAT蛋白中的47～57(YGRKKRRQRRR) 位氨基酸才是真正具有转导作用的区域，被称为蛋白转导结构域(protein transduction domain，PTD)［3］。该区域能转导自身及与其融合的多肽、蛋白及DNA分子进入几乎所有组织和细胞，甚至血脑脊液屏障，转导效率高且对细胞无明显的损伤［4-6］。PTD的发现，在研究蛋白功能和 治疗 方面有重要作用。绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)相对分子质量为27 ku，在395 nm波长光的激发下可以发射出明亮的绿色荧光［7］，它的表达没有种属特异性，而且产生的荧光不需要辅助因子、底物或其他基因表达产物的协助，灵敏度高。GFP在活细胞、组织或器官中无需任何处理即可在荧光显微镜下直接观察，加之动物体内不产生内源性GFP，因此成为活细胞理想的标记物［8］。增强型绿色荧光蛋白(eGFP) 是GFP的突变体，在480 nm波长的激发光下可以发射出比GFP亮35倍的绿色荧光［9］，作为报告蛋白，已经广泛应用于基础实验研究。我们利用本实验室现有的PTDeGFP载体，构建同一个目的蛋白的全长和其不同结构域（即片段1和片段2）的表达质粒，在大肠埃希菌中表达，得到3种纯化的蛋白，研究PTDeGFP携带的3种不同分子质量融合蛋白的穿膜效率和能力。 　 　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　pET28aPTDeGFP目的蛋白，pET28aPTDeGFP片段1，pET28aPTDeGFP片段2载体由我室构建［10］；工程菌E.Coli DH5α，Rosetta和Jurkat为本实验组保存。纯化树脂Profinity Ni2+IMAC金属螯合填料（美国BioRad公司 ），蛋白标准参照购自Fermentas公司，鼠抗6×HisTag单克隆抗体(Cell Signaling公司)，HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗(北京中杉金桥公司)，ECLplus显色试剂盒、PD10脱盐预装柱(美国GE公司)，异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG Dioxane Free）（Merck公司，德国），小牛血清（杭州四季青公司），Bradford蛋白定量试剂盒为北京普利莱公司产品，PRMI 1640培养基（Invitrogen公司），24孔细胞培养板和细胞冻存管等购自Costa公司，RPMI1640细胞培养基购自Hyclone公司。 　　1.2 仪器 　　尼康(Nikon)全光谱共聚焦显微镜C1Si，流式细胞仪FACSCaliber（美国BD公司）。 　　1.3 方法 　　1.3.1 3种融合蛋白的诱导表达及纯化。 　　将我室构建的pET28aPTDeGFP载体［10］上分别插入目的基因及其片段，测序正确的质粒pET28aPTDeGFP目的基因，pET28aPTDeGFP片段1，pET28aPTDeGFP片段2分别转化大肠埃希菌Rosetta，筛选出阳性克隆，平板上挑单个菌落至3 ml LB 培养基（含50 μg/ml卡那霉素3 μl），37℃摇床培养过夜后以1∶100稀释后，将菌液接种于200 ml LB培养基，37℃增菌培养至D(600 nm)=0.4～0.6时加入终浓度为