实时检测PCR扩增.PPTVIP

实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 戚振华 2012年12月15日 Contents Click to add title in here 1 2 3 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的方法介绍 实时荧光定量PCR的应用 实时荧光定量PCR定义： 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。 与普通PCR的区别 普通PCR技术 实时定量PCR技术 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性。 Ct值的定义： 扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。 Ct值 定量PCR的数学原理 ?理想的PCR反应： X=X0*2n ?非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0(1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= -log(1+Ex) *Ct+ log M (3) 最后结论： Log X0与Ct呈线性关系，根据样品扩增的Ct值就可计算出样品中所含的模板量。  Log起始拷贝量与Ct呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。 标准曲线 实时荧光定量PCR的方法介绍 DNA 产物的荧光标记 非特异性荧光标记： 1、SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon SYBR Green法工作机理 SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光。 变性时，DNA双链分开，无荧光。 在延伸结束阶段采集荧光信号。 SYBR Green也能和非特异的双链DNA结合发光，所以必须在反应结束时做熔解曲线分析。 SYBR Green 熔解曲线分析 融解曲线分析，单一峰，无非特异性荧光，定量准确 融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确 SYBR Green法优缺点 优点 缺点 对DNA模板没有选择性--适用于任何DNA 使用方便--不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性，但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件 对引物特异性要求较高 TaqMan法 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光 Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针 TaqMan法工作原理 每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号 TaqMan法PCR反应的建立 引物、探针的设计：探针Tm为68-70℃，30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60℃ 反应参数的确定：一般为：95 ℃,3min 、 94 ℃，15S 、60 ℃，60S（Taq酶5′→3′外切酶活性在60℃最高也可通过温度梯度优化退火温度） 优化引物和探针浓度：引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM 其他与常规PCR相同 TaqMan法优缺点 优点 缺点 对目标序列的高特异性--阴性结果确定 引物设计相对简单 重复性比较好 只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 荧光定量PCR技术的应用 绝对定量 基因表达研究 转基因食品检测 相对定量 基因在不同样本中的表达差异 药物疗效考核 阴阳性分析 病原体（HBV，HCV等）检测 禽流感检测 等位基因分型 SNP分析 与疾病相关的等位基因点突变检测 拓展应用 MicroRNA分析 基因拷贝数分析 表观遗传学分析 蛋白质分析 肿瘤稀有突变检测 两种定量的不同方法 绝