纳米雄黄脂质体的制备、特性检测和体外抗肿瘤细胞作用的研究.doc

　　纳米雄黄脂质体的制备、特性检测和体外抗肿瘤细胞作用的研究 【关键词】 纳米脂质体； 雄黄； 特性; 抗肿瘤作用 近年来，我国学者将主要成分为三氧化二砷（As2O3）的中药砒霜用于 治疗 急性早幼粒细胞白血病，效果良好，从而引起了人们从肿瘤治疗学角度研究砷剂的极大兴趣。雄黄与砒霜同属于含砷矿物类中药，其主要成分为As2S2和As4S4，并夹杂少量As2O3和其他重金属盐。传统医学认为，雄黄具有解毒、燥湿、祛痰、截疟等作用; 现代 医学研究表明，雄黄还具有抗肿瘤作用。以往的研究证实其对慢性粒细胞白血病、骨髓增生异常综合征等恶性血液系统疾病疗效显著。与砒霜相比，雄黄含砷量低，毒性相对较小，所以有很广阔的应用前景［1］。但目前雄黄采用传统中药制剂工艺使其入药非常困难，需经研磨、水飞等繁复的工艺手段，存在耗时、废料、毒性大、颗粒偏大、生物利用度较低等缺点，因此我们在看到雄黄临床应用价值的同时，通过制备药物新剂型，以减少用药量、提高疗效，具有非常重要的临床意义。 1 材料与方法 1.1 试剂和仪器 雄黄（南京药材公司），天然大豆磷脂（Lipoid，德国），胆固醇（北京奥博星生物技术责任有限公司），维生素E（Sigma，美国），明胶（AMRESCO，美国），其余均为化学纯。H600透射电子显微镜(Hitachi,日本)，能谱仪(Thermo NORAN Vantag,美国)，旋转蒸发器（河南巩义英裕子华仪器厂），超声波清洗器（上海超声波仪器厂），ZETA SIZER 3000激光粒度分析仪（MALVERN，英国），高压均质机（Avestin，加拿大）。 1.2 实验方法 1.2.1 纳米雄黄脂质体的制备 将雄黄原粉粉碎后用2 mol·L-1的盐酸40 ℃浸泡2 h并不断搅拌，用蒸馏水冲洗至中性，过滤。用浓盐酸浸泡24 h，蒸馏水冲洗至中性，过滤，弃滤液，得到去除杂质元素的雄黄粉末。将上述预处理后的雄黄粉末加入Na2S溶液，磁力搅拌，使充分反应。去离子水反复冲洗，过滤，弃渣，缓慢滴加 0.2 mol·L-1的盐酸，并不断搅拌，将最后生成的纳米雄黄4 ℃避光保存。 纳米雄黄脂质体采用薄膜分散高压均质法制备，将配方量天然大豆磷脂、胆固醇、维生素E置于圆底烧瓶中，加入适量无水乙醚充分溶解，超声2 min，置旋转蒸发器减压蒸发至有机溶剂完全挥发，在瓶壁形成一薄膜。取前面制备的纳米雄黄溶于明胶PBS液中，加入圆底烧瓶中，高速搅拌30 min，使薄膜完全脱落。加入甘油后置-20 ℃冰箱，2 h后取出37 ℃冻融，超声10 s后继续置-20 ℃，反复处理两次后，在高压均质机60～70 MPa压力下均质处理3～4次，4 ℃条件下保存。 1.2.2 纳米雄黄脂质体的表征 将制备的纳米雄黄脂质体滴有膜铜网，透射电镜下观察其形貌及大小。扫描电镜视野下任意选几个纳米颗粒，用能谱仪对其成分进行分析，验证雄黄纳米脂质体已成功制备。另取适量纳米雄黄脂质体，用缓冲液稀释后，用ZETA SIZER 3000 激光粒度分析仪进行粒径测定，应用动态光散射软件进行数据处理，记录平均粒径、多分散性指数。 纳米雄黄脂质体包封率测定：取1 ml雄黄脂质体，置于eppendorf管中，12 000 r·min－1离心5 min，收取离心液，用原子荧光光谱仪测定离心液及洗涤液中砷的含量。按 中国 药典2000年版脂质体包封率的 计算 公式计算包封率,即包封率 = (I 1640培养液中，在37 ℃、饱和湿度及5％CO2的细胞培养箱内传代培养。取对数生长期细胞用0.25%胰酶、RPMI 1640中止消化，吹打成单细胞悬液，计数，用培养液调成细胞浓度为6×104 ml－1,将细胞接种到96孔培养板中，100 μl·孔－1，置于37 ℃、5％CO2 培养箱中培养24 h。实验组用RPMI 1640培养液将纳米雄黄脂质体稀释成雄黄浓度分别为5和10 mg·L-1，对照组加入RPMI 1640培养液，继续培养24和48 h。每孔加MTT液20 μl (5 mg·L-1，PBS配制)，继续培养4 h后吸尽上清液，加二甲基亚砜（DMSO）每孔150 μl，振荡溶解10 min。用酶标仪在492 nm下测OD值。根据公式“细胞的存活率（％）＝各实验组OD值/对照组OD值×100％”计算细胞存活率。用倒置显微镜观察细胞形态，拍照。 2 结 果 2.1 形态观察 天然雄黄外观呈土状块或石块状；制备的纳米雄黄为淡黄色液体状；纳米雄黄脂质体为淡黄色乳状液，分散良好，久置不分层。 透射电镜下观察发现，传统的雄黄粉末呈方形、多边形或不规则晶体状，直径较大，在5 μm左右甚至更大（图1）。 纳米雄黄脂质体近似球形，分散性良好，粒径分布在100～500 nm。经高压均质处理后，