PITC柱前衍生HPLC氨基酸比值测定.docVIP

PITC柱前衍生氨基酸比值240.30 异亮氨酸 约30 mg 131.11 亮氨酸 约35 mg 131.11 半胱氨酸是以胱氨酸折算成两份半胱氨酸进行计算。用0.1mol/L盐酸溶解至250ml。 衍生方法 取标准品（样品）0.2ml，加100mmol/L异硫氰酸苯酯乙睛溶液0.1ml，加1mol/L三乙胺乙睛溶液0.1ml，混匀，室温放置1小时，加入0.4ml正己烷，振摇，放置10分钟，取下层清液过滤后进样。 三．实验部分 1.色谱条件选择 1.1精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度。用以下3个方法进行检测。从而确定最佳洗脱条件。 方法1 流速：1ml/min 检测波长：254nm 柱温：40℃ 进样体积：2ul 洗脱梯度： 时间 B％ 0 0 4 3 16 11 17 21 32 34 34 100 38 100 38.01 0 45 0 方法2 流速：1ml/min 检测波长：254nm 柱温：40℃ 进样体积：2ul 洗脱梯度： 时间 B％ 0 0 11 7 13.9 12 14.0 15 29.0 34 29.1 100 37.0 100 37.1 0 45.0 0 方法3 流速：1ml/min 检测波长：254nm 柱温：40℃ 进样体积：2ul 洗脱梯度： 时间 B％ 0 0 4 0 31 25 41 80 45 80 45.1 0 50 0 1.2 根据实验结果，确定最佳洗脱条件后，更改进样量为1ul。从而确定进样量的改变是否影响检测。 1.3 在WS-10001-（HD-0903）-2002规定用0.02mol/L盐酸溶液，但是考虑到某些氨基酸在0.02mol/L盐酸中不溶，所以改成0.1 mol/L盐酸溶液。为考察pH是否有影响，所以根据先前实验结果，确定最佳洗脱条件后，进行以下实验。 ①精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度。 ②精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加2ml0.1mol/L盐酸溶液后加水至刻度。 ③精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加水至刻度。 1.4 WS-10001-（HD-0903）-2002中规定使用外标法，但由于氨基酸分析过程比较复杂，影响因素较多，而且取样量比较少。查阅欧美药典，发现氨基酸分析中采用内标法以减少分析误差。 内标溶液1：称取α—氨基丁酸10mg，加水溶解至250ml。 内标溶液2：称取正亮氨酸10mg，加0.1mol/L盐酸溶解至100ml。 ①精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加5ml内标溶液1，再加5ml内标溶液2，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（100pmol/L）进样一针。 ②精密量取4ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加5ml内标溶液1，再加5ml内标溶液2，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（200pmol/L）进样一针。 2.检测方法学验证 通过色谱条件选择后，能确定最佳的检测条件，然后进行以下检测方法学验证。 2.1线性 内标溶液：称取α—氨基丁酸10mg，加水溶解至100ml。 ①精密量取1ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加1ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（50pmol/L） ②精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加2ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（100pmol/L） ③精密量取4ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加4ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（200pmol/L） ④精密量取6ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加6ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（300pmol/L） ⑤精密量取8ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加8ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（400pmol/L） 2.2重现性 精密量取4ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加4ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（200pmol/L）（分别衍生6次） 2.3稳定性 精密量取4ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加4ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（200pmol/L） 分别于0小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、24小时进样。 四．结果汇总 1.1色谱条件选择 ①根据实验情况和液相图谱，方法3的梯度洗脱简单，基线相对平稳。 ②进样量的改变会影响氨基酸的峰形，进样量改为1ul时，不易产生拖尾等现象。 ③稀释氨基酸标准贮备液的溶剂改变（即改变标准品溶液pH