在实验室决定实验成败几个关键细节.docVIP

【分享】在实验室决定实验成败的几个关键细节 细节决定实验的成败，有些往往是我们一些小的疏忽导致实验的失败。追其原因我总结了以下几点经验，与 大家分享： 1跑page胶的时候，小电压跑会避免高电压产生的热量尔导致的胶层变形。低电压泳道会比大电压泳道跑的 直一些，且分离效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分离。 2. 提取质粒的时候，最后一步的酒精挥发很关键，基本上是其后续的酶切反应的决定性因素。所以这一步 尽量挥发长一点时间，最好是空调吹热风，或是37度温箱放长一点的时间，我试过室温过夜，酶切很好。 3. 做WESTERN BLOT 的时候，大家往往会摸索一抗、二抗的浓度，封闭时间，曝光时间等等，而每次变换 其中的一个条件就需要从新跑胶、转膜，甚至重新提蛋白，这样会浪费大量的时间。其实完全没有必要这样 。一次转膜后，将PVDF膜晾干，裁减成小块，保存起来，用的时候取出一块，没有任何影响。这对于摸索 条件的战友来说，节约了大量的时间。 4. 有关缓冲液和培养基配置 1）将缓冲液配方中的成分分别以10－100倍配成母液储存，需要的时候只需将相应的母液混合，补加水稀 释即可 2）配培养基时通常会忘记各成分的量，如配LB时的三个成分不记得到底哪个是5g，哪个要10个，因此可以 在常用的试剂瓶的标签上注明所需的量，如配LB时，在NaCl瓶外注明10g/L, yeast 5 g/L, tryton 10 g/L等 ，很方便，不需要每次配之前临时翻书 5. 有关PCR主反应液配置: 在做克隆鉴定的时候经常需要在酶切鉴定前进行PCR鉴定，每次配置PCR反应液很繁琐，可以将其配置类似 kit的形式，按你需要的反应体系列表，然后放大100倍配置100×主反应液（100次反应），其中含buffer， Mg2＋，dNTPs，但不含引物和Taq酶，然后可以10×分装或一管储存在－20度，在需要的时候拿出融开， 然后按所需的PCR反应个数吸取相应的倍数，再补加相应反应倍数的Taq和引物，混匀后分装，这样做的好 处如下： 1）可极大的节省宝贵的时间，可早点收工，看球 2）避免每次反应加样不均的可能 3）大大减少PCR假阳性的产生 6. 有关酶切反应液的配置: 在做酶切时，也可以象PCR一样配置主反应液，每次反应前先列好反应的体系，算好需要的反应数，然后按 所需反应的体系按所需反应数放大，加入buffer、酶、水，质粒栏空缺，然后混合后按除质粒DNA的体积分 装，然后再在每管中加入相应体积的质粒DNA酶切，这样做的好处如下，特别是当同时有10几个阳性克隆 需要鉴定时尤为明显： 1）各反应成分均一 2）可大大减少限制型内切酶的使用 3）节省时间 7. 有关SDS－PAGE： 1）可将SDS－PAGE的积层胶，分离胶预先配好大体积如100ml储存在4度冰箱（注：10％AP，TEMED不加 ，切记！！！），每次配置时只需吸取相应体积的预制胶加入AP，TEMED即可，没必要每次制胶时候翻分 子克隆，特别方便，而且，这样的预制胶可储存半年以上，不失为偷懒的绝佳方法；更关键的是可大大减少 与丙稀酰胺的接触，因此大大减少中毒的机会。 2）电泳时虽然小电泳分离效果要好一些，但2小时以上的等待的时间实在是痛苦，因此可以提高电泳至 150V，但需要将整个电泳槽放在放满冰水的脸盆里散热，这样跑出来的胶分离效果丝毫不比低电压来的差 ，关键是时间大大节省，不需1h即可看结果了 8. 实验中小窍门我想能够分成两类：一类是“非常规”操作；一类是常规操作过程中一些省时省事手段。 前一类，我举个例子：有时候第一天涂的转化平板、次日早晨转化子可能长成的菌落比较大（1~2毫米以上 ，BL21就长得快），下一步转化子做质粒鉴定。这个情况下可以直接挑取一块菌苔（勿带出培养基），50 微升酚/氯仿悬浮菌体，放置两分钟，加40微升TE抽提，上层TE吸出后再氯仿抽提一次，吸取上层TE即是 质粒提取液。提取的质粒可以直接用于电泳和酶切。这样操作，可以省去转接液体试管的培养步骤，至少节 省6~8小时的时间。但是，要在各步骤都控制得很好的情况下才能保证提取和酶切的效果，不同的实验室或 者操作者未必能够很方便地重复其实，其它的一些“小窍门”也是如此。 后一类的小窍门则在实验室中无处不在。如：平行作不同样本的PCR,模板DNA加量一样，配置PCR体系可以 一起配制后分装这点做过试验的都知道，但是配制的时候配制量可以比预期分装量稍多一点（如用100微 升则配110微升），这样可以避免有时候分装不够的尴尬，因为不同特别是大小不同的枪，会有误差。再比 如：楼上有站友说的sds胶预配（APS和TEMED、或者后者先不加）的问题，实际上时间放置过长肯定 影响效果，如果要在一天内连续地跑两次板，何尝不可？又比如，配sds胶的时