原核表达及纯化方法.docVIP

原核表达及纯化-His tag 原核表达 挑取一个单菌落（重组表达载体），接种到10mL LB培养基中（注意抗生素抗性）。37℃，过夜摇菌。 次日，将菌液接种到1L LB培养基中（1:50~1:100），继续培养至OD600=0.6时（0.6~0.8），加1×IPTG诱导4h。（加IPTG前留样（诱导前全菌蛋白）200μL做SDS） 收菌： (1)200μL诱导后全菌； (2)小量表达：收集5mL诱导后全菌，12000g离心1min，裂解沉淀，分别收集上清（可溶性）和沉淀（包涵体）中的蛋白。 大量表达：收集1L诱导后全菌，4℃，4500g离心15~30min。 可溶性分析 目的：重组蛋白是否表达，是可溶性的还是包涵体形式。根据这个结果选择纯化方法。 （1）各用30μL 4×SDS Loading buffer重悬诱导前和诱导后的菌体（200μL）； 用500μL 1×Binding Buffer重悬菌体（5mL），超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g离心15min，分离上清和沉淀； （2）用30μL 4×SDS Loading buffer重悬沉淀； （3）取10μL上清蛋白加10μL 4×SDS Loading buffer； （4）将诱导前全菌，诱导后全菌，上清蛋白和包涵体蛋白煮沸5~10min。 （5）各取10μL 用于SDS检测（12%的胶）。 小量富集实验 样品制备： 取5mL诱导全菌，用500μL 1×Binding Buffer（8M Urea）溶解，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。（留样做SDS） 富集： 装柱：取30μL~50μL体积的Ni柱料（纯柱料）于1.5mL离心管中。 平衡：向离心管中加200μL 1×Binding Buffer（8M Urea），混匀1min，700g离心1min，去上清；重复一次。 上样：将制备的上清蛋白加到离心管中，混匀30min（混匀仪上）。700g离心1min，上清即为穿透（留样做SDS）。 淋洗： 加50μL 1×Binding Buffer（8M Urea，5mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS； 加50μL 1×Binding Buffer（8M Urea，10mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS； 加50μL 1×Binding Buffer（8M Urea，20mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS； 洗脱： 加50μL 1×Elution Buffer（8M Urea，50mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS； 加50μL 1×Binding Buffer（8M Urea，3000mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS； 取少量柱料做SDS； 注：用定量工作液估计蛋白的浓度：2μL待测蛋白溶液+180μL定量工作液，根据颜色的变化可以估计蛋白的浓度。对富集过程进行监控。 大量富集实验 样品制备：用50mL 1×Binding Buffer（8M Urea）溶解菌体，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）或者用高压破碎仪（推荐）。4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。（留样做SDS） 富集： 装柱：将1mL Ni柱料装入层析柱，用至少三个柱体积的超纯水以工作流速（每滴/3S）压实柱料，以获得均一的柱床，同时避免带入气泡。 注：以下的层析操作流速不要超过装柱流速的1.75倍。 柱平衡：三个柱体积的1×Binding Buffer（8M Urea）平衡柱料。 注：柱子挂上镍离子后，可在Binging 溶液中过夜，4℃。 上样：视样品的多少可选用LOOP或由泵直接上样两种方式，接穿透峰以备SDS检测。 淋洗：去除非特异结合的蛋白质，接穿透峰以备SDS检测。 10个柱体积的1×Binding Buffer（8M Urea）； 6个柱体积的WASH Buffer（分别是含有10mM 咪唑，20mM 咪唑的1×Binding Buffer（8M Urea））； 注：也可以根据定量工作液错落估计蛋白的浓度，以确定每步的淋洗是否完全。 洗脱： 6个柱体积的1×Binding Buffer（8M Urea，50mM咪唑）； 6个柱体积的1×Binding Buffer（8M Urea，100mM咪唑）； 6个柱体积的1×Binding Buffer（8M Urea，300mM咪唑）； 留样做SDS； 注：也可以不使用含100mM咪唑的洗脱液；至于每步用多少体积的洗脱液，可根据粗略定量而定；