单细胞PCR实验方法.docxVIP

单细胞PCR方法总结 实验内容： RNA的提取 用随机引物合成cDNA miRNA特异的反转录 对mRNAs和miRNAS做Real-time PCR 一、RNA的提取 防止RNA酶污染的措施：1.? ?所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。2.? ?提取RNA所用的枪头，EP管泡在配制好的depc中，摇振过夜，然后倒掉depc注意要到干净，再高压，为了防止仍残留液体可120度干烤一会（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3.? ?有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。4.? ?配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。5.? ?操作时戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤??。 DEPC（焦磷酸二乙酯）水的配制： 取DEPC 1ml，加入1L待处理水（蒸馏水等）中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时。这样的DEPC水可用来处理实验用的枪头和PCR管。也可高压灭菌，使DEPC分解为CO2和乙醇，用以配制所需溶液。 注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作 实验原理：TRI使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。TRI试剂能够有效地溶解DNA、RNA和蛋白质，加入氯仿后离心，混合物分成三个相，水相中含RNA，中间相含DNA，有机相含蛋白质。这样即可使RNA与蛋白质和DNA分离。水相中的RNA 可用异丙醇沉淀浓缩，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA 中如含无机盐，则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。Glycogen（糖原）可作为DNA和RNA的分子载体，从少量样品中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。 所需试剂： 试剂量/每反应 （μL）TRI试剂15.0糖原1.0氯仿5.0异丙醇10.075%乙醇100.0无核酸酶水7.1实验步骤： 手动显微操作获取单细胞样品 注：用胰酶消化下来的细胞要用PBS清洗两遍再进行操作。 立即将细胞转移到含15μLTRI试剂的离心管中并重悬三次[1]以确保裂解和把细胞内含物转入管中。单细胞样品可在TRI试剂中-80℃保存备用。 3、向每个含有单细胞的管中加入1 μL 无核酸酶的 glycogen。（操作时最好不要同时操作12个管以上） 每个管中加5μL氯仿，大力摇晃。 5、离心12,000g 15 min 4°C。在离心过程中，一般使用0.2-mL adapter或1.5-mL tube holder来避免管子损坏。 小心地吸取水相（约10μL）加入一个新的0.2mlPCR管中，再在管中加入10μL异丙醇，翻转七到十次确保充分混合，注意不要漩涡或震动管子。室温下孵育10min。离心12,000g 15 min 4°C，以沉淀析出的RNA。为避免损失RNA颗粒，将离心管的盖子封闭端朝向离心机的边缘放置。在处理这些肉眼不可见的微量物质时，好的实验习惯是非常必要的。将离心管定向放置，可以确定离心后沉淀的位置，即在盖子封闭端的方向，吸取上清时就可注意，避免搅乱沉淀物质。 按照上步的位置小心地弃去上清液。 加入100μL 75%的乙醇，简单的漩涡一下 离心 12,000g 15 min 4°C，离心管与第7步同样放置 小心地弃上清。 室温下适度干燥（5min以内），过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。 每管中加7.1μL水，用枪头吹打使其彻底重新悬浮。吸3.55μL到新管中来做miRNA反转录，余下的3.55μL做cDNA合成。两管RNA均保存在冰上。尽量少用枪抽吸，以免破坏RNA结构。 提取的RNA可立即用随机引物合成cDNA，通过cDNA合成mRNA表达分析。然后通过miRNA-specific做miRNA表达分析。 二、用随机引物合成cDNA 使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits，它包含由全RNA合成单一条带的cDNA的全部试剂，反应容量为5 μL，每个反应最多需2μgRNA. 操作要求：勤换手套，不要把PCR扩增产物放在PCR设置区，小心地开闭所有的反应管或反应板，不要发生液体飞溅的情况，尽可能地使反应及其内含物封闭。 试剂盒内容 试剂量（200次反应）10? RT Buffer, 1.0 mL