植物细胞工程实验讲义.docVIP

实验的预习报告可按这里的材料写，但是实验报告必须根据真实的实验情况写 实验二 植物组织培养培养基的配制与灭菌 一、实验目的与意义 学习培养基配制与灭菌的操作方法。 　　对植物外植体进行离体培养时，要依靠培养基提供生长所需的营养成分。不同材料对培养基的要求不同，适当的设计和选用培养基，对植物组织培养取得成功至关重要的。另外，对组织培养物的脱分化和再分化等状态的调控，次生代谢产物的生产等都是通过调节培养基成分来实现的。培养基的主要成分包括无机营养物质、碳源、有机物质、植物生长物质等。 二、实验器材 天平、烧杯（1000ml）、医用瓷缸（1000 ml）、三角瓶、量筒（100ml）、移液管、玻璃棒、pH试纸、吸耳球、线绳、封口膜、石棉网。 三、实验药品 蔗糖、琼脂、1mol/L NaOH、HCl、各种培养基母液。 四、实验步骤 （一）?????? 培养基配制（以1L MS培养基为例） 1、计量 根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，计算公式：吸取量 ml=培养基中物质的含量（mg/L）×1000ml/母液浓度（mg/L）。 2、移液 取医用瓷缸一只，按照计算吸取母液的量依次吸取各母液置于医用瓷量杯中备用。 注意： ①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制。 ②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次。 ③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1 种，划掉1种，以免出错； ④移液管不能混用。 3、称取 称取8g琼脂，30g蔗糖备用 4、融化 用搪瓷量杯量取600～700ml的蒸馏水放在电炉上，加入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，加入蔗糖。 注意： 在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。 5、混合 将融化的琼脂和母液充分混合，用蒸馏水定容到1000ml，来回混合几次。 6、调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.4～7.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH达到要求为止(在调制时要比目标pH值偏高0.2～0.5个单位，因为培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，pH值会下降0.2～0.5个单位左右)。 注意： 调至时要用玻璃棒不停的搅拌,使其充分混合。 7、分装 溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 ml或100 ml)中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。每1L培养基，可分装25～30瓶。 8、包扎 用封口膜封口，外边可加一层牛皮纸，扎好绳子，用铅笔或碳素墨 水笔在牛皮纸上写上培养基的代号。 注意： 培养基中的部分成分在高温灭菌时易发生化学变化，致使培养基pH值降低，从而使琼脂凝固力下降，发生培养基灭菌前凝固，灭菌后不凝固现象。避免此现象发生的方法是:调整培养基pH值，一般不低于5.6，若需酸性较强培养基，可适当增加琼脂用量。 （二）培养基的灭菌 培养基中含有大量的有机物质，特别含糖量较高，是各种微生物滋生、繁殖的好场所。而接种材料需要在无菌条件下培养很长时间，如果培养基被污染，则达不到培养的预期结果。因此，培养基的灭菌，是植物组织培养中十分重要的环节。常用的灭菌方法是高压灭菌和过滤除菌。 1、高压蒸汽灭菌法 把分装好的培养基及所需灭菌的各种器具、蒸馏水等，放入高压蒸汽灭菌锅的消毒桶中，外层锅内加水，水位高度不超过支架高度。盖好锅盖，上好螺丝，注意上螺丝要对角线上。加热后，锅上压力表指针开始移动，当指针移至0.5kg/cm2时，扭开放气阀排除冷空气，使压力表指针回复零位。当指针移至1.1～1.2kg/cm2时，即121℃时，维持一定的时间。由于容器的体积不同，瓶壁的厚度不同，所以灭菌的时间也要适当考虑，具体可以参考表1。灭菌后要趁热取出三角瓶，不可久不放汽，让压力锅自行冷却，这样易将棉塞等闷得太湿，引起后来长霉污染。培养基自然冷却凝固。放置1 d后再使用。 ? 表1 培养基高压蒸汽灭菌所必须的最少时间 容器的体积(ml) 在121℃下最少灭菌时间(min) 20~50 15 75~150 20 250~500 25 1000 30 1500 35 2000 40 注意： （1）锅内冷空气必须排尽，否则压力表指针虽达到一定压力，但由于锅内冷空气的存在事