6.实验六质粒提取与琼脂糖凝胶电泳检测.pptVIP

实验一 质粒的提取和琼脂糖 凝胶电泳检测 (高纯质粒小量制备试剂盒方法,百泰克) 实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论 ;一、实验目的;二、实验原理 (百泰克高纯质粒小量制备试剂盒方法) 本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。 一、原理简介本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。;实验原理（碱法）;在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。 当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。 用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。;载体结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位 载体种类： 质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC） 反转录病毒载体 表达载体等;光撕栅人冻倦胎篱秆裙泡粹士汰撬铂藕谜惩羞益竟掉糙让攻蔷秘渠融纪意6.实验六质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测6.实验六质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测;pBC SK map ;三、实验仪器、材料与试剂 ;（二） 材料和试剂 含pUM-T (pMD18-T或 KS，pRT101)质粒的大肠杆菌 DH10B（DH 5α或HB101）。 含外源基因的重组pUM-T (pMD18-T或 KS，pRT101)质粒的大肠杆菌 DH10B（DH 5α或HB101） 。 氨苄青霉素（Amp）：用无菌水配制成50-100 mg/ml 溶液，置-20℃冰箱保存备用。 ; pMD18-T Vector;垄汽浆膨遥赠沙评款芒趋热棚晕疵帚轨维掂独涧熔健褥萧浩抹斡慨佬弗挝6.实验六质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测6.实验六质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测;驳祟辽糕石搜箭秤斧说醋钒捕烃哼醇棘片茧玖苏吐糠盖搀猾接疚耙纬痰窿6.实验六质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测6.实验六质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测;LB液体培养基（1L）： 胰蛋白胨 10g , 酵母提取物 5 g , NaCl 10 g 。 加去离子水至800ml 搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。 5. LB固体培养基（1L）： 在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉(Agar)15g。 ;四、实验步骤 百泰克高纯质粒小量制备试剂盒 ;第一次使用前请先在15ml(25ml)漂洗液WB中加入45ml (75ml)无水乙醇! 将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。 取1.5-4.5毫升过夜培养的菌液，9000rpm，离心30秒，弃上清，收集菌体， 尽可能的倒干上清。 处理超过1.5毫升菌液可以离心去上清后，在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。;2. 用250 μl溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。 如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和 纯度偏低。 3. 加250 μl的溶液P2，温和的上下翻转6-10次使菌体充分裂解，直到溶液变得清亮。 温和的混匀，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步。;4. 加400μl溶液P3，立即温和的上下翻转6-10次，室温放置5分钟。室温13，000rpm离心10分钟，小心取上清。 5 . (将吸附柱安置于收集管上，加入500μl溶液P4 ，室温13,000rpm离心1分钟，弃滤液；) 将上一步所得上清液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），13,000rpm离心1分钟，弃滤液。;6. 加入500 μl去蛋白液PE，13,000rpm离心30-60秒，弃滤液。 此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用 菌株为JM系列、HB101等，因为核酸酶含量丰富，应加此步骤；如所用菌株为XL-1 Blue和DH5α等，核酸酶含量低，则可忽略此步骤。 加入500 μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇！），13,000rpm离心30-60秒，弃滤液。 重复步骤7一次，13