3细胞凋亡和增殖原位检测120227.pptVIP

细胞增殖与凋亡的原位检测技术;一、细胞增殖活性原位检测技术;①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间； G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。 ②S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期， ③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间； ④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。;依据细胞的分裂能力，机体的细胞分为三类： 不稳定细胞(labile cells) ， 持续分裂细胞 稳定细胞(stable cells) ， 静止细胞 处G0期 永久细胞(permanent cells) ，不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞; 根据细胞周期将细胞群分为两类 分裂细胞指进入G1期后进行分裂的细胞； 非分裂细胞是指处于G0期细胞及非增生的终末细胞。; 增殖分数或生长分数 分裂细胞与细胞总数之比值。 生长分数值越大，增殖活性越高。 测定生长分数能判断细胞群的增殖活性，即增殖快慢。 ;生理状态下： 不稳定细胞、稳定细胞呈现着活跃或较活跃的增生，补充因凋亡而丧失的细胞，保持机体、器官或组织细胞数量的动态平衡 。 ;; 原位研究细胞增生活性，不仅涉及生理性及反应性细胞增生，更多是研究肿瘤细胞的增生活性。;（一）原位检测细胞增生活性的常用方法及注意事项 测定细胞增生活性的方法有： 核分裂像计数 Feulgen染色后显微分光光度法 免疫组织（或细胞）化学技术显示与细胞增生与 分裂 相关的抗原 嗜银核仁组织区法(argyrophil-stained nucleolar organizer region AgNORs) ;3H标记胸腺嘧啶脱氧核苷掺入标记技术 溴脱氧尿嘧啶核苷（胸腺嘧啶脱氧核苷相似物）标记技术 流式细胞术测定S期细胞分数 ;1. 核分裂像计数;神柑包朽滚鸵搏变芝段师恐箍约稻天票润逮霍抑晋搀绊辑纶是纷螺膏残碰3细胞凋亡与增殖的原位检测1202273细胞凋亡与增殖的原位检测120227;核分裂像计数有两种方法 高倍视野法（HPF） 一般在400倍放大下，随机选择一定数量（10个或更多）的HPF，分别观察并计数其中的核分裂像，最后算出平均每个HPF中的核分裂像数。 ;核分裂指数（MI） 测量时，可在显微镜目镜内放置网格测微尺，随机选择一定数量的视野，计数不同区域一定数量的网格内核分裂像数，最后算出占所测细胞总数之比例，实质上，也是一种生长分数 。 ;注意事项： 严格控制切片厚度 在较厚的切片观察时，微调显微镜可在不同平面计数核分裂像，与较薄切片相比，显然增加了计数机会。 组织标本固定时间 若组织不及时固定，细胞仍有分裂机会，也会增加核分裂计数可能性。 切片不能过染 切片过染会导致核分裂像辨认困难。 用同一台或HPF面积相同的显微镜计数 ; 2.免疫组织（或细胞）化学方法 通过染色细胞增生相关的核蛋白判断细胞的增生活性。 Ki67 因其所测的蛋白只表达在G1，G2，M和S期的细胞，G0 期及G1早期细胞不表达。 ; PCNA 是针对增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的抗体。在除G0期外的其它时相细胞均可测出。但水平不一，G1期迅速增加，G1/S交界期达高峰，S期维持高水平，G2期开始下降，G1早期和M期表达水平最低。 ;MCM蛋白（微染色体维持蛋白） 是启动DNA复制和延伸的关键蛋白。只在具有增殖潜能和增殖细胞中表达。可显示整个细胞周期细胞。;DNA拓扑异构酶Ⅱa 是一种核酶，参与DNA复制、基因转录、染色体聚集及催化有丝分裂和减数分裂的染色体分离，在细胞增殖中其重要作用。;细胞周期中不同时期的关卡蛋白或调节元件 细胞周期素A、B、C、D、E 周期素依赖性激酶（CDK）; Ki67或PCNA抗原在核内表达．故增生细胞的核呈棕色或红色，用苏木素衬染也能清楚区分阳性与阴性细胞。;Ki67;Ki67;Ki67;PCNA;PCNA; Ki67LI，PCNA LI 采用计数核分裂像的方法，计数并算出标记细胞与所测细胞总数