E―钙粘蛋白、可溶性E―钙粘蛋白在胃部疾病中的检测及其意义.docVIP

E―钙粘蛋白、可溶性E―钙粘蛋白在胃部疾病中的检测及其意义 　　摘要：目的 研究E-钙粘蛋白（E-cad）、可溶性E-钙粘蛋白（sE-cad）的检测在早期诊断几种胃部疾病，包括慢性萎缩性胃炎、胃溃疡、胃黏膜肠上皮化生、胃癌的临床意义。方法 139例因出现胃肠道症状而接受胃镜检查并配合活检确诊为慢性萎缩性胃炎38例，胃溃疡33例，胃黏膜肠上皮化生28例，胃癌22例，18例无任何病例改变者作为正常对照组。采用免疫组化及双抗夹心酶联免疫吸附法分别检测各标本组织中E-cad的表达情况及胃液中sE-cad水平。结果 慢性萎缩性胃炎组、胃黏膜肠上皮化生组、胃癌组E-cad的表达均较对照组有下降，其差异有统计学意义（P0.01）；慢性萎缩性胃炎组、胃黏膜肠上皮化生组、胃癌组血清中sE-cad的水平较对照组升高，其差异有统计学意义（P0.01）。结论 胃黏膜组织中E-钙粘蛋白的表达情况及血清中可溶性E-钙粘蛋白的水平检测可作为胃癌及癌前病变的有力依据。 　　关键词：E-钙粘蛋白；可溶性E-钙粘蛋白；胃炎；胃黏膜肠上皮化生；胃溃疡；胃癌 　　E-钙粘蛋白（E-cadherin，E-cad）作为细胞粘附分子成员之一，其表达的上调或下调对炎症的发生，肿瘤的的侵袭、转移有密切关系[1-2]。国内外研究发现，胃癌组织中E-cad的表达较正常胃黏膜组织明显减少或缺失，且呈异质性或非极性变化[3-4]。本文选取确诊为胃癌及癌前病变的几种胃部疾病患者，检测其胃黏膜组织中E-cad的表达及血清中sE-cad的水平。 　　1 资料与方法 　　1.1一般资料 收集2010年1月～2015年12月我院门诊、普外科、消化内科因胃部疾病而接受采血及胃镜检查明确诊断的139例患者，其中男性74例，女性65例。 　　1.2方法 　　1.2.1标本采集 所有对象于胃镜前1d晨空腹采集，所采集静脉血静置1 h，2500 rpm，离心10 min，获取血清，放置低温冰箱，-80℃保存待测。 　　1.2.2免疫组织化学检测 一抗为兔抗人E-cad抗体，标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，片厚5 μm，经脱蜡水化后微波抗原修复。免疫组化采用S-P法，E-cad单克隆抗体及S-P试剂盒均为Santa Cruz公司生产，按照说明书操作。操作步骤：①石蜡切片的脱蜡水化：切片置于烤箱中65℃融蜡2 h后，于二甲苯中脱蜡二次（5 min/次），再依次浸入浓度梯度乙醇中（依次为无水乙醇-无水乙醇-95%-85%-75%乙醇），最后置于蒸馏水中各水化5 min。②石蜡切片的抗原修复：石蜡组织切片用柠檬酸缓冲液高压修复。其中修复工作液配制：在1 L去离子水中加入10 ml柠檬酸缓冲液（即IHC抗原修复液，100×），均匀混合即可。具体修复步骤：将修复液置于高压锅中，并将待修复切片浸泡于修复液里（液体必需盖过组织），盖上高压锅盖，加热直至高压锅喷汽，立即开始计时，1～2 min后将高压锅撤离热源，自然降温，取出切片，用蒸馏水（0.01 M，pH值7.4）漂洗2～3次，持续3 min/次。③滴加适量试剂1（即内源性过氧化物酶封?]液），室温下孵育10 min后，用PBS充分洗涤。④滴加适量试剂2（封闭用正常羊血清工作液），室温下孵育10 min后，轻轻甩干。⑤滴加适量一抗工作液（按适当比例稀释的浓缩抗体即1∶200兔抗大鼠E-cad抗体）后，置于湿盒中，并于4℃冰箱中孵育过夜，第2d晨用PBS充分淋洗，轻轻甩干。⑥滴加适量试3（生物素标记山羊抗兔二抗工作液），室温孵育30 min后，用PBS充分淋洗。⑦滴入适度的试剂4（HRP 标记的链霉亲和素），室温下孵育10 min后，用PBS洗涤充分。⑧DAB显色剂的制备：按实验所需量，将试剂B与试剂A以19∶1的体积比混匀后即可。也可选择每毫升试剂B中滴加1滴（约50 μl）试剂A，混匀后即可。⑨显色剂显色：加适量的上述显色液滴于需要显色的组织切片上，立即显色，控制时间在1～5 min。通过显微镜下观察控制显色时间，当达到最佳显色效果后，立即自来水冲洗终止显色。显色后的切片经复染、脱水透明，封片后，于电子显微镜下观察结果并拍片。取正常胃粘膜作为阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。正常胃黏膜E-cad在粘膜上皮细胞膜着色呈棕黄色。根据着色细胞数目和着色强弱来判断结果。观察每张病理切片对角线的8个视野，根据文献[5]将染色计为0～3分。0分：细胞膜、细胞质均未染色；1分：细胞质染色为主；2分：异质性染色（细胞膜、胞质混合染色）；3分：连续的细胞膜染色。 　　1.2.3 ELISA法检测 将-80℃保存的标本置于室温溶解，各待测标本的sE-cad浓度检测操作步骤严格按sE-cad ELISA试剂盒说明书进行。 　　1.3统计学处理 各样本计