2γ-氨基丁酸(GABA)的分布及测定方法.doc

γ-氨基丁酸（GABA）的分布及测定方法 周青 生物化工 2110805057 一、分布： γ-氨基丁酸在动、植物体内都有分布，在动物体内，GABA主要分布于神经组织中，在哺乳动物的脑组织内分布最为集中，其含量是单胺类含量的1000倍，而在外围器官中含量很少。在植物体内，GABA是细胞自由氨基酸库的重要组分，胞液中有几种构型，可形成类似脯氨酸的环状结构。高等植物组织中GABA含量通常在0.3～32.5μmol／g之间，超过许多蛋白质类氨基酸的含量。在一些与根瘤菌共生固氮植物的根瘤中，GABA以结合态形式存在，苜蓿中结合态形式的GABA高达干重的6.6%[1]。除此之外，GABA还存在于以下植物中，见表一。 表一 富含GABA植物 物料 GABA含量 谷物类 糙米[2] 3.8mg/100g 胚芽[2] 25.4 mg/100g 处理后米胚芽[3] 350～400 mg/100g 发芽糙米（处理后）[4] 40.00 mg/100g 米糠[5] 10.90 mg/100g 米糠水提取液[6] 0.125 mg/100ml 米糠水提取液酸水解液[6] 0.253 mg/100ml 根茎叶类 桑叶[7][8] 226.0 mg/100g 茶鲜叶（CO2气体嫌气处理5h）[9] 180.2 mg/100g 乌龙茶（先萎凋，后嫌气处理）[9] 245.9 mg/100g 红茶（先萎凋，后嫌气处理）[9] 176.5 mg/100g 贵州苦丁茶[10] 7.130 mg/100g 鲜蕨[11] 235.2 mg/100g 天花粉原料 栝楼根[12] 0.200% 川贵栝楼根[12] 0.490% 王瓜根[12] 0.860% 长猫瓜根[12] 0.240% 菠菜[13] 414 nmol/g 土豆[13] 166 nmol/g 红薯[13] 137 nmol/g 山药[13] 129 nmol/g 羽衣甘蓝[13] 122 nmol/g 二、γ-氨基丁酸（GABA）含量的测定方法 ①薄层色谱： 原理：用一定波长的光照射在经薄层层析后的层析板上，对具有吸收或能产生荧光的层析斑点进行扫描，用反射法或透射法测定吸收的强度，以检测其浓度。 方法：展开剂是正丁醇：醋酸：水=4：1：1。分别吸取5μl γ-氨基丁酸标准品溶液和样品洗脱液，点于自制的硅胶薄层板上， 以正丁醇：醋酸：水体积比为4：1：1为展开剂展开，取出晾干，用体积分数0.2％茚三酮乙醇溶液显色，105℃烘数分钟，直至获最大斑点，用Camag TLC scanner 3 扫描仪扫描。扫描条件为：反射式双波长锯齿扫描,扫描波长λS=515nm,参比波长λR=680nm，狭缝50×0.45 mm。黄怀生用最小二乘法对标准溶液点样量和色谱峰面积值进行回归分析，其相关系数可达到0.99以上[14]。黄美娥[15]用此方法测得得蕨菜叶、茎中γ-氨基丁酸的质量分数分别为0.319％ 、0．141％。 采用双波长扫描法[16]，可以避免分离度不佳的其他氨基酸的相互干扰；二、双波长扫描可以排除背景干扰使基线平直；三、能提高灵敏度。 ②纸电泳法： 原理：纸上电泳法，以纸为支持剂，使带电的γ-氨基丁酸于纸上在外电场作用下定向移动，从而达到分离目的。 方法：取上清液用于点样于滤纸上，以标准GABA溶液做对照，在电压300V、室温条件下电泳60min，电泳缓冲液为吡啶-冰醋酸混合溶液[吡啶：冰醋酸：蒸馏水(体积比)=2：2：121，pH4.7]。电泳完毕后取出电泳纸，水平摆放，室温下自然晾干，再在80℃电烘箱中风干，挥发掉残留吡啶和醋酸。用喷雾法向电泳纸上均匀喷洒显色剂，于电热恒温干燥箱中90℃烘10 min，即显出在有氨基酸区域呈紫红斑点的层析图谱。将与GABA标准品位置一致的斑点剪下，加4ml洗脱液(洗脱液由0.1％硫酸铜溶液和75％乙醇溶液按1:19的体积比混合而成)洗脱90min，在520nm波长处比色测定洗脱液的吸光度[17,18]。 ③纸层析法 原理：纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，利用不同物质在固定相中的分配系数不同，而使混合样品达到分离的层析方法。 方法：展开剂V(正丁醇)：V(醋酸)：V(水)=4：1：3，茚三酮溶解于展开剂中，质量浓度为0.4g/L，在展开过程中，茚三酮随着展开剂沿滤纸向上移动。点样后的滤纸条在展开剂中展开、风干显色，将与标准品位置一致的斑点剪下，用洗脱液[V(1 g／L硫酸铜)：V(体积分数75%乙醇)=2：38]洗脱，520nm处比色测定[19,20]。 ④比色法： 原理：利用苯酚和次氯酸钠与游离氨反应显色。 方法：先做GABA标准曲线：取不同浓度的GABA标准液0.4ml，加0.2m