高效液相色谱仪测定发酵液中的氨基酸含量.doc

高效液相色谱仪测定氨基酸的含量 1 L--色氨酸含量的测定 实验仪器与试剂 色氨酸样品，甲醇，高效液相色谱仪，0.03%KH2PO4溶液 1.2 HPLC色谱分析条件 流动相为0.03%KH2PO4溶液（A）-甲醇（B），线性梯度淋洗，流速1.0mL/min，柱温 35℃，检测波长276nm。 流动相 时间（t/min） 5 10 15 20 A（%） 80 90 80 70 B（%） 20 10 20 30 标准溶液的配制 精密称取色氨酸标准标准品50mg，置100ml容量瓶中，振摇，用流动相溶解到刻度，作为供试品溶液，另取色氨酸样品适量，同法操作。 标准直线的制作 精密称取色氨酸标准样品适量 ,分别稀释制成每1ml 中含色氨酸50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg 的溶液，注入液相色谱仪，以色氨酸峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标，制作回归标准直线。 发酵液中样品中色氨酸含量的测定 取发酵液，稀释配制成约 500μg/ ml 的溶液，摇匀，过滤，取25μl进样，在高效液相色谱仪下测量，记录峰值面积，作图。 L-精氨酸含量的测定 实验仪器与试剂 L-精氨酸标准样品，乙腈，高效液相色谱仪，磷酸二氢铵。 PH计，磷酸， 　HPLC色谱分析条件 流动相: 以磷酸二氢铵溶液 ( 称取磷酸二氢铵1.15g, 加水800m溶解后, 用磷酸调节pH 值至2.0±0.1, 加水稀释至 1000ml ) - 乙腈为流动相，线性梯度淋洗; 柱温为30℃检测波长为206nm；进样量：25μl。 标准直线的制作 精密称取精氨酸标准标准品50mg，置100ml 容量瓶中，振摇，用流动相溶解到刻度，作为供试品溶液，另取色氨酸样品适量，同法操作。精密称取精氨酸标准样品适量 ,分别稀释制成每1ml 中含精氨酸50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg 的溶液，注入液相色谱仪，以精氨酸峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标，制作回归标准直线。 发酵液中样品中精氨酸含量的测定 取发酵液，稀释配制成约 500μg/ ml 的溶液，摇匀，过滤，取25μl 进样，在高效液相色谱仪下测量，记录峰值面积，作图。 L-甘氨酸含量的测定 实验仪器和试剂 乙酸铵溶液；乙腈；L-甘氨酸标准样品；高效液相色谱仪。 ＨＰＬＣ色谱分析条件 流动相:A为0.02%mol/L乙酸铵溶液（PH=6.5）:B为乙腈，线性梯度淋洗；流速: 110 mL/min ；柱温:30℃；进样量:２0μL。 梯度洗脱表3 流动相 时间（t/min） 10 20 30 40 50 60 A（%） 80 60 40 40 60 80 B（%） 20 40 60 60 40 20 标准直线的制作 方法同2.2节 发酵液中样品中甘氨酸含量的测定 方法同2.5节 L-甲硫氨酸含量的测定 4.1 实验仪器和试剂 L-甲硫氨酸标准样品；甲醇；醋酸钠；高效液相色谱仪。 HPLC色谱分析条件 流动相: A为甲醇 , B为 50 mmol /L的醋酸钠缓冲溶液;流速1 . 0 mL /min;梯度洗脱见表1，测定波长为 262 nm，柱温为30℃。 梯度洗脱表4 流动相 时间（t/min） 10 20 30 40 50 60 A（%） 30 50 80 85 100 100 B（%） 70 50 20 15 0 0 标准直线的制作 方法同2.2节 发酵液中样品中甲硫氨酸含量的测定 方法同2.5节 回收率实验 　 称取甘氨酸标准液50μg/ml分别稀释0、1、2、4、6、8、10倍，每份取1ml，按标准样品处理方法，过滤，测定标准样品中的甘氨酸的含量，计算回收率。