多糖中十六烷基三甲基溴化铵含量的测定方法.docxVIP

多糖中CTAB含量的测定方法【说明书】：技术领域本发明涉及测试分析领域，具体地涉及一种利用高校液相色谱测定脑膜炎球菌多糖中CTAB含量的方法。背景技术CTAB，全称为十六烷基三甲基溴化铵，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在多糖纯化过程中，CTAB作为螯合剂使复合糖得以沉淀。然而CTAB具有一定的刺激性，可因吸入、咽下或皮肤吸收而使人体受到危害。近年来，在生物制品申报过程中，国家规定应明确CTAB等有机物质残留量以降低制品风险。因此准确测定脑膜炎多糖原液中CTAB的残留量对疫苗生产有着重要影响，对疫苗产品质量控制具有重要的意义。目前，国内外尚无文献报道脑膜炎球菌多糖原液及脑膜炎球菌多糖疫苗中CTAB残留量的测定方法，因此如何对脑膜炎球菌多糖疫苗中的CTAB进行检测尚不确定。发明内容本发明目的是提供一种快速而准确的脑膜炎球菌多糖原液中CTAB含量的测定方法。为实现本发明目的，提供的测定方法包括以下步骤：取CTAB标准溶液和脑膜炎球菌多糖溶液样品，分别上样于高效凝胶色谱柱，根据色谱图计算脑膜炎球菌多糖溶液样品中CTAB的浓度。具体地，包括以下步骤：（1）制取CTAB标准溶液作为样1，其浓度标记为C1；（2）取待检的脑膜炎球菌多糖溶液，作为样2；（3）样1、样2分别上样于高效凝胶色谱柱；（4）记录色谱图并进行积分计算；（5）根据公式计算样2中CTAB的浓度。其中，凝胶色谱柱为TSKgel?G5000色谱柱。其原理是根据样品分子大小不同进行分离，CTAB与肺炎多糖分子大小间存在差异，可被有效分离。其中，流动相为（0.8-0.9%）NaCl溶液。其中，上样体积分别为20-100μl；洗脱流速为0.4-0.6ml/min。其中，在检测波长为214nm下记录色谱图。其中，所述脑膜炎球菌为A群脑膜炎球菌、C群脑膜炎球菌、Y群脑膜炎球菌、W135群脑膜炎球菌中的任意一种。其中，根据色谱图进行积分计算，利用以下公式计算脑膜炎球菌多糖溶液样品中CTAB的浓度：将CTAB标准溶液作为样1，其浓度标记为C1；将待检的脑膜炎球菌多糖溶液样品，作为样2；根据公式（Ⅰ）计算样2中CTAB的浓度：C2=（S2÷S1）×C1，其中，S2为样2对应的峰面积，S1为样1对应的峰面积；根据公式（Ⅱ）计算样2中CTAB的百分含量：F=（C2÷C0）×100%，其中，C0为待检脑膜炎球菌多糖溶液样品中的多糖浓度。在本发明优选的实施方案中，检测脑膜炎球菌多糖中CTAB含量的具体步骤为：（1）精密制取CTAB标准溶液作为样1，其浓度标记为C1；（2）取待检的脑膜炎球菌多糖溶液，作为样2；（3）充分平衡色谱柱后，将样1上样于凝胶色谱柱进行洗脱，记录色谱图：洗脱峰开始所对应时间标记为t1，洗脱峰结束所对应时间标记为t2；（4）对样1色谱图进行积分，积分窗口为从t1到t2，得到样1对应的峰面积为S1；（5）将样2上样于高效凝胶色谱柱进行洗脱；（6）对样2色谱图进行积分，积分窗口为从t1到t2，得到样2对应的峰面积为S2；（7）根据公式（Ⅰ）：C2=（S2÷S1）×C1?????????（Ⅰ）计算样2中CTAB的浓度；（8）测定待检脑膜炎球菌多糖溶液中的多糖浓度，标记为C0；（9）根据公式（Ⅱ）：F=（C2÷C0）×100%?????????（Ⅱ）计算样2中CTAB的百分含量。本发明根据CTAB分子与脑膜炎多糖分子间大小存在差异，利用二者在凝胶层析时的保留时间不同，采用高效液相色谱法将CTAB与脑膜炎球菌多糖分离，利用已知浓度的CTAB作为标准对照，从而准确测定脑膜炎球菌多糖原液中CTAB含量。本发明的有益效果为：本发明提供了一种准确、重复性好、快速、便捷的脑膜炎球菌多糖原液中CTAB含量的测定方法，当CTAB浓度在6.25-100μg/ml时，线性相关系数r大于0.9990，变异系数CV小于3%，平均回收率在98%以上，从而建立了评价脑膜炎球菌多糖原液质量的新方法。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1检测方法的考察1.1线性关系考察精密称取CTAB10mg，用0.85%NaCl溶解并定容至10ml，作为对照品贮备液（浓度为1mg/ml）。精密吸取CTAB对照品贮备液10ml，定容至100ml容量瓶，作为对照品工作液（浓度为100μg/ml）。将对照品工作液依次稀释至浓度100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml，吸取不同浓度的对照品溶液，依次进样20μl，记录色谱图。以峰面积（Y）为纵坐标，对照品溶液X（μg/ml）为横坐