shRNA干扰VEGF表达对白血病细胞多药耐药的影响.docVIP

　　shRNA干扰VEGF表达对白血病细胞多药耐药的影响 ：方莉莉， 许文林， 陈琛， 房新建， 陈巧云， 李娟 【摘要】 目的： 探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）与人白血病耐药细胞株K562/A02细胞多药耐药的关系及其机制。方法： 针对VEGF基因设计合成3条干扰片段shRNA1，2，3，采用脂质体2000分别将其转染入K562/A02细胞，RTPCR法检测VEGF和多药耐药相关基因MDR1，MRP1，topoⅡ，GST的mRNA水平；蛋白质印迹法检测VEGF蛋白水平；MTT法检测各组细胞对多柔比星的半数抑制浓度（IC50值）。结果： K562/A02细胞VEGF mRNA表达水平显著高于敏感株K562细胞，差异有统计学意义（Plt;0.01），且VEGF蛋白水平也显著高于K562细胞；转染shRNA后，K562/A02细胞中VEGF mRNA水平出现不同程度下调，其中shRNA2组和shRNA3组与转染随机片段组比较差异有统计学意义（Plt;0.05），以shRNA3组下调最显著，并且VEGF蛋白水平也出现相应的下调；转染48 h后K562/A02细胞中MDR1，MRP1及topoⅡ的mRNA水平均出现不同程度下调，以shRNA3组下调最显著，分别下调（39.7±1.21）％，（29.1±0.97）％，（28.2±1.04）％，GST基因表达则无明显变化；阳性转染组细胞对多柔比星的敏感性明显增加，其中以shRNA3组最显著。结论： VEGF shRNA可以抑制K562/A02细胞VEGF基因与蛋白的表达，不同干扰片段的沉默效果不同，并增强K562/A02细胞对多柔比星的敏感性，其机制可能与MDR1，MRP1及topo Ⅱ的表达下调有一定的关系。 【关键词】 血管内皮生长因子； RNA干扰； K562/A02细胞； 多药耐药 ［Abstract］ Objective: To study the relationship betultidrug resistance of human leukemia cell line K562/A02 by RNA interference, and then the mechanism ine 2000 reagent.RTPCR RNA level; DRassociated genes such as MDR1,MRP1 and topoⅡ in K562/A02 cells ultidrug resistance 多药耐药（MDR）目前仍是急性白血病（AL） 治疗 的主要障碍，尽管新的化疗药物和化疗方案不断涌现，但仍有部分患者因化疗耐药而导致治疗失败。白血病细胞的耐药往往同时存在数种耐药机制，MDR1，MRP1等耐药相关基因的高度表达是白血病产生多药耐药的主要原因之一。血管内皮细胞生长因子（VEGF）作为最重要的促血管生成因子之一，在肿瘤增殖、浸润和转移中起着重要作用。最近的研究表明［1］，在急性白血病初诊、缓解、难治/复发各组骨髓及外周血中，VEGF水平均高于正常对照组，特别是在难治/复发性AL患者中，VEGF的表达水平最高，表明VEGF水平的变化和白血病病情、预后密切相关。因此，我们采用RNA干扰技术阻断白血病细胞株K562/A02细胞中VEGF的自分泌作用，观察细胞对药物敏感性的变化，并针对VEGF影响K562/A02细胞多药耐药的作用机理进行初步探讨。 1 材料与方法 1.1 材 料 转染试剂Lipofectin2000，Trizol试剂、胞核/胞质蛋白提取试剂盒、DAB显色试剂盒、RPMI1640培养液及无血清无抗生素OPTIMEMI培养液购自Invitrogen公司，RTPCR相关试剂购自Fermentas公司，VEGFA鼠单克隆抗体购自Ebioscience公司，VEGF shRNA1，2，3及通用阴性对照HK由武汉晶赛生物工程技术有限公司合成。人慢性粒细胞性白血病细胞系K562细胞购自中科院上海细胞库，K562/A02细胞购自南京凯基生物有限公司。 1.2 VEGF shRNA1，2，3的合成 以人VEGF mRNA序列(NM_001025366，NM_001025367，NM_001025368，NM_001025369，NM_001025370，NM_001033756、NM_003376)同源CDS序列设计shRNA双链，本研究选取的VEGF mRNA的靶位点分别是：shRNA1（636～654）：5′GGCGTCGCACTGAAACTTT3′，shRNA2（1352～1370）：5′GCGGATCAAACCTCACCAA3′，shRNA3（1414～1432）：5′GTGAATGCAGACCAAAGA