缺氧对膀胱平滑肌细胞缝隙连接蛋白表达的影响.docVIP

　　缺氧对膀胱平滑肌细胞缝隙连接蛋白表达的影响 【关键词】 平滑肌细胞；细胞缺氧；不稳定膀胱；缝隙连接蛋白；膀胱出口梗阻 ABSTRACT: Objective To study the pathogenesis of unstable bladder ent based research on connexins in both unstable bladder group and cell hypoxia group. Methods Unstable bladder rat models ooth muscle cells RNA levels of Cx40, Cx43 and the Cx43 protein expressed in the smooth muscle cells from the unstable bladder group and cell hypoxia groups operation group and normoxia groups) (Plt;0.01). In the cell hypoxia groups, cells exposed to 15min hypoxia expressed much higher Cx43 than the other tight cause cell hypoxia and the increased expression of connexins. In our study, cell hypoxia also increased the expression of connexins. Therefore, ight play a key role in connecting partial bladder outlet obstruction and unstable bladder. KEY EM培养基，在37℃、5%(体积分数)CO2环境下培养。 1.2 细胞鉴定 第2代细胞行细胞鉴定后，第3代细胞用于实验。缺氧组细胞随机分为缺氧15min组、缺氧30min组和缺氧1h组，缺氧对照组细胞随机分为15min组、30min组和1h组。 1.3 主要试剂 抗αSMactin抗体，购自博士德公司；总RNA提取试剂盒、一链合成试剂盒及PCR试剂盒均购自加拿大BBI公司；Cx40、Cx43及内参18S引物由上海基康生物技术有限公司设计合成；抗Cx43多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；生物素标记羊抗小鼠IgG购自Sigma公司；缺氧液按比例配制[8](mmol/L：NaCl[3]，KCl 12，MgCl2 0.4，CaCl2H2O 0.9, HEPES 4，乳酸钠20，蒸馏水500mL)后，调pH值至6.2，抽滤除菌后4℃保存。 1.4 细胞鉴定 使用特异性抗αSMactin抗体(工作浓度1∶100，购自博士德公司)，将传代细胞悬液滴于盖玻片上，待细胞生长至80%～90%融合时取出，40g/L多聚甲醛固定20min后，Triton破膜20min，20mL/L小牛血清封闭30min，抗αSMactin抗体4℃孵育过夜，生物素标记二抗为羊抗小鼠IgG(工作浓度1∶200，购自Sigma公司)室温孵育1h，ABC(avidinbiotin plex 试剂盒购自美国Vector Laboratories公司)试剂反应30min，3，3二氨基联苯胺(3′ 3diaminobenzidine, DAB)显色，苏木素复染、脱水、透明、封片，空白对照组用1×PBS取代一抗，余操作相同。 1.5 建立细胞缺氧模型 缺氧组细胞分为缺氧15min组、缺氧30min组、缺氧1h组，将各组细胞培养液倒干净后，无菌PBS冲洗三遍后将培养瓶烘干，加入提前用高纯氮气饱和30min的缺氧液，根据培养容器大小继续充入一定量高纯氮气以驱赶容器中剩余的空气，迅速密闭后放入缺氧盒中，置37℃、5%(体积分数)CO2培养箱培养15min、30min、1h。缺氧对照组细胞以培养基代替缺氧液，换液后在37℃、5%(体积分数)CO2环境下培养15min、30min、1h。 1.6 RTPCR检测Cx40和Cx43 按照试剂盒说明书提供的步骤提取总RNA，合成一链后进行PCR反应。建立25μL扩增反应体系：cDNA 1μL、10×Master Mix 12.5μL、ddH2O 10.5μL、上下游引物各0.5μL。PCR反应条件为94℃预热5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环后72℃最后延伸6min。反应产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳，并扫描入凝胶成像系统进行分析，结果以平均吸光度值(Cx/18S)表示。 1.7