NGS各技术平台汇总-2015.pdfVIP

NGS 各技术平台汇总 一、 基本概念 （☆☆☆☆☆） 1. 文库：把DNA样本片段化或筛分成指定长度的目标序列，再加上寡核苷酸接头 （和 条形码），用于 后续测序上机。 DNA 片段的大小是 NGS 文库构建的主要因素。片段化可以通过不同的方法，比如 PCR 扩增法。（NGS 实验流程相对复杂，在过程中会应用到PCR 扩增技术） 2. 读长：被片段化后的 DNA 链长度，二代测序通常是100-200 bp （bp 是双链DNA 碱基对单位） 3. 通量：一次测序上机可以运行的样本 （基因）数量 4. 测序深度：一个基因片段被扫描的次数，测序深度深可提高低频突变检出率和检测 准确率 5. 全基因组测序：一种生物的全部基因序列的测序，人的基因组序列约 3G，基因组 是一个细胞或者生物体所携带的全部遗传信息。 6. 全外显子组测序：一种生物的外显子序列的测序，外显子测序需要将全基因组外显 子区域DNA 捕获并富集后进行测序；人的外显子序列只占全部基因序列的1%，约 30MB，是基因组的编码序列；相对于基因组测序分析的信息量小，成本较低。 7. 转录组测序：细胞内转录产物RNA 的测序，广义上包括mRNA、核糖体RNA、转运 RNA 及非编码RNA；狭义指所有mRNA 的集合 8. 靶向测序：目标区域/序列/位点 测序 二、 一代测序简介 1. 发生和发展：（☆☆☆） 第一代测序技术是Sanger 于20 世纪70 年代中末期发明的双脱氧链终止测序法，手 动测序，用同位素标记，Sanger 也因此获得其第2 个诺贝尔奖 （在Sanger 发明双脱 氧链终止测序法前Walter Gilbert 发明化学降解法测定DNA 序列）； 80 年代出现第一台自动化测序设备，荧光标记代替同位素，计算机图像识别； 90 年代中期 测序仪重大改进，毛细管电泳替代凝胶电泳； 2003 年完成人类基因组测序工作。 2. 基本原理：（☆☆） 以单条DNA 链为模板合成互补链，在 DNA 复制过程中，合成原料（2’脱氧核苷酸 dNTP ）中掺入标记过的 2’3’ ddNTP （双脱氧链终止测序法由此而来），就会产生一 系列末端终止的DNA 链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA 链的长度 是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP 决定的。经PCR 扩增反应，可以得到一系 列长度不同的产物，由于ddNTP 带有荧光标记，对产物进行电泳分离，并用相应的 仪器进行检测，就可以读出模板的序列。 链终止法反应的核心仍是PCR 法。 3. 主要平台提供方：(☆☆☆☆☆) ABI 公司 三、 二代测序简介 1、Roche 454 测序: 454 测序是大规模平行测序的开始。（☆☆☆☆☆） 2003 年底，454 公司推出了基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统—Genome Sequencer 2.0 System(GS)。2005 年 454 公司被罗氏诊断公司收购，之后优化推出 Genome Sequencer FLX System (GS FLX) 。罗森博格博士是该技术的创始人, 也是Ion Torrent平台的创始人。454 平台的突出优势是长读长(400nt) ，但准确率低，成本高。 是高通量测序的过渡。 454 测序技术的具体步骤为：（☆☆） （1）构建测序文库。将基因组DNA 打碎成300～800 个碱基片段后，在两端加上 锚定接头； （2 ）乳液PCR 扩增。扩增产生成千上万个拷贝； （3 ）焦磷酸测序。复制过程中如果发生碱基互补配对，就会释放1 个焦磷酸，在 一系列酶的催化下，释放出荧光信号，会被 CCD 捕获到。每个碱基反应都会捕获