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基因工程操作复习提纲 考试题型 选择题、判断题、填空题、问答题 提纲（重点在于理解、熟悉操作过程原理，了解操作注意事项） 什么是基因工程、基因工程主要操作流程、基因工程的主要应用？ 基因工程：是将不同来源的基因（DNA分子），按照工程学的方法进行设计，在体外构建成杂种DNA分子，然后导入受体细胞，并在受体细胞内复制、转录、表达的操作。基因工程又称DNA重组技术。 操作流程：（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。 （2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。 （3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。 应用：医药业：疾病的预防;病的诊断;病的治疗 农业及食品工业: 提高作物抗性;改良作物品质;延长果实货架期;用农作物生产药物 畜牧业;加工食品 环境: 环境检测;环境净化 什么是基因？ 是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。 什么是质粒？质粒的分类和性质？ 质粒是一种裸露的,结构简单,独立于细菌DNA之外,并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 两种类型：紧密控制型和松弛控制型 EDTA可螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用EDTA的存在有利于溶菌酶的作用因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境溶菌酶是破碎细菌的有效方法NaOH和SDS促使染色体DNA与质粒的变性酚氯仿抽提从核酸溶液中去除蛋白质LiCl在质粒DNA提取中的作用是沉淀大量蛋白质和高分子RNA乙醇沉淀DNA时加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷排斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀 琼脂糖凝胶电泳的原理和应用？ 原理：以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。 型 型 型限制酶识别并切割特异的双链DNA序列多种因素可引发星型反应反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大酶切反应所加入的酶量应适中反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA,可维持酶的稳定性酶切底物DNA应具备一定的纯度其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、大于10mM的EDTA去污剂SDS以及过量的盐离子浓度要保证酶作用时的最佳反应条件（ph, 温度）和底物用量反应混合物混匀时应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整反应前的低速离心是必要的这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底单酶切只用一个限制性内切酶去切质粒，环状的质粒成为线状的，质粒的大小不变双酶切用两个限制性内切酶，质粒上产生两个缺口，环状质粒变成两段线状DNA。Pcr原理、操作过程、注意事项？ 基本原理模板DNA引物在耐热DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA分子合成。感受态即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响 制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置 15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链生成磷酸二酯键1、连接反应的温度：DNA连接酶的最适反应温度为３７，但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是１２过夜。 2、DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。 二者连接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。 3、 碱性磷酸酶处理质粒载体：为了提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，增加重组子比例。这样就会出现DNA自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。 4、连接反应的检测：连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。 5、如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲