组织细胞脱分化再分化愈伤组织根芽植物体植物组织培养过程.PPT

第四章 愈伤组织的诱导、继代及分化 【学习目的与要求】 掌握愈伤组织的诱导与继代培养、分化与植 株再生的两种发生途径及愈伤组织形态发生 的调控因素。 【主要内容】 第一节 愈伤组织的诱导与继代培养 第二节 愈伤组织分化与植株再生 第三节 愈伤组织形态发生的调控因素 第一节 愈伤组织的诱导与继代培养 植物组织培养（Plant Tissue Culture）：指通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体explant），接种到培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其产生完整植株的过程。 愈伤组织（Callus）：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。 一.愈伤组织形成条件 虽然如全能性所言，发育和分化过程并不导致细胞全能性的丧失。但是，在一个完整的植物中，每个分化细胞都是某个器官和组织中的一个成员，它只能在与其周围成员相互协调和彼此制约当中，恰如其分地发挥整个植株所赋予它的一定的功能，而不具备施展其全能性的外部条件。 一.愈伤组织形成条件 若是一旦脱离了母体植株，摆脱了原来所受到的遗传上的控制和生理上的制约，在一定的培养条件下，就会发生一种回复变化，从而失去分化状态，变为分生细胞，实现脱分化过程。然后，这些脱分化细胞经过连续的有丝分裂，形成愈伤组织（离体隔离）。 一般认为静止细胞并未丧失其分裂潜能，只是分化过程中产生一类抑制剂阻碍其分裂的能力，若去除抑制物质即可使分化的体细胞恢复分裂活力。 机械损伤是引起诱导组织细胞分裂的刺激因素。 一.愈伤组织形成条件 外植体可以是各种器官或组织，理论上讲诱导愈伤组织成败的关键不在于外植体，而在于培养条件，其中激素的成分和浓度是极为重要的因素。特别是生长素类对于细胞分裂的诱导以及其后的生长增殖，是必要的物质。 二.愈伤组织的诱导 外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程被大致划分为三个时期（诱导期、分裂期和形成期）。 1.诱导期：细胞分裂的准备期 接种的外植体细胞通常都是分化的成熟细胞，处于静止状态，细胞大小没有多大变化，外观无明显特征，但在外源激素作用下，细胞内物质代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸等物质的合成。 王凯基等（1981）在研究离体培养的油橄榄茎段时发现，细胞内合成代谢活跃，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大。 2.分裂期：开始分裂到持续分裂的时期 分裂期是指细胞通过一分为二的分裂，不断增生子细胞的过程。外植体的细胞一旦经过诱导，其外层细胞开始迅速分裂，使细胞脱分化。分裂期主要表现如下： ① 细胞的数目迅速增加。如胡萝卜培养7天后，细胞数可增加10倍。 分裂期：开始分裂到持续分裂的时期 ② 细胞体积小，内无液泡，细胞的核和核仁增大到最大。如同根尖和茎尖的分生组织细胞特性。 ③ 细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变。 ④ 随着细胞不断分裂和组织生长，细胞的总干重、蛋白质和核酸含量大大增加，新细胞壁的合成极快。 3.形成期：形成无序结构的愈伤组织的时期 形成期是指外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织的时期。进入形成期后，细胞的平均大小相对稳定，不再发生变化，细胞分裂由原来局限在组织外缘的平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂，结果形成瘤状或片状的拟分生组织，称做分生组织结节。 形成期：形成无序结构的愈伤组织的时期 分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心，或者进一步分化为维管组织结节——由分生组织结节外围的细胞作平周分裂成为形成层状细胞，并形成了部分维管组织如管胞、纤维细胞等，但不形成维管系统。 愈伤组织的形态特征 来自不同植物或是不同部位外植体的愈伤组织，其质地、颜色和物理性质差异很大。有的很紧密坚实，有的很疏松脆弱或呈胶质状；有的呈淡黄色，有的呈白色或淡绿色等。不同质地、颜色的愈伤组织再分化能力不同。 愈伤组织在长期的继代培养中能够形成分生组织区、管胞和色素细胞或是体细胞胚，这种能够形成体细胞胚的愈伤叫做胚性愈伤组织。 三.继代培养 脱分化细胞不断进行分裂形成愈伤组织，愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上继续培养。这个过程叫做继代。通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持在不分化的增殖状态。 三.继代培养 一般在愈伤组织生长至直径2～3cm(4～6周)时将其切成小块继代培养。可以根据需要选取合适质地、颜色的愈伤进行培养。继代培养时应切