第二章白质分子构象的研究方法.ppt

第二章 白质分子构象的研究方法 从50年代初开始，陆续出现了一些测定溶液中蛋白质构象的实验技术。重氢交换、紫外光谱以及旋光色散是50年代的实验方法。 60年代，圆二色性光谱法取代了旋光色散法，重氢交换法发展出氘交换法，同时，还增加了核磁共振，荧光光谱以及激光拉曼光谱等新的实验技术。这些技术可以测定溶液中蛋白质分子的局部构象，并且能在一定程度上对构象变化的过程提供信息。 到目前为止，除了核磁共振法外，这些实验技术还存在着较大的局限性.从广度上说，没有一个能提供蛋白质分子的完整的三维结构；从深度上说，很少能提供原子水平的结构信息。 80年代，核磁共振法有了得大突破，用二维核磁共振法测定溶液中蛋白质分子三维结构，取得了成功。 近年来，中子衍射法在测定蛋白质分子的三维结构方面，已初露锋芒。它可以测出多肽链上所有原子的空间排布。 生物系统复杂的层次： 分子?细胞?组织?器官?系统 ?个体?种群?群落?生态系统?生物圈 结构生物学： 针对生物系统的不同层次进行研究 结构分子生物学： 研究生物大分子的三维结构与功能。以生物大分子结构及其运动的测定为基础，阐明生物分子的功能，并进而解释生命现象的科学 蛋白质构象测定思路： 通过探索蛋白质在结构变化过程中的各种光学、物理学等特征的变化，了解结构信息 紫外差光谱 Tyr在pH6和pH13的吸收光谱 荧光测定 荧光分光光度计工作原理图 酪氨酸的吸收光谱与荧光光谱 Trp、Tyr和Phe的荧光光谱 荧光测定的指标 荧光测定中猝灭剂的作用 荧光测定中荧光探针的作用 （二） 荧光光谱法 （fluorescence spectrum): 有些物质吸收入射光后经过一段很短时间, （10 - 9 ~10 - 8 s）又发射出波长比原来长的光——荧光 激发能的耗散：①热运动 ② 传递给相邻分子 ③发荧光形式 蛋白自身的荧光: λTrp = 348nm； λPhe = 282nm； λTyr = 303nm 配基的荧光: 如叶绿素，FAD、藻胆素等 结合人工荧光探针的荧光 量子产率（量）： Q = 发射的荧光光子数 吸收的光子数 圆二色性Ⅰ 椭圆偏振和椭圆率 圆二色性Ⅱ 圆二色性Ⅲ 圆二色性Ⅳ 圆二色性Ⅴ 多聚赖氨酸不同构象的标准远紫外CD光谱 圆二色性Ⅵ 圆二色性Ⅶ 圆二色谱(CD) ： ?? ~? 或 摩尔椭圆度[θ] ~ ? 作图 光源? 自然光 单色器 单色光 起偏振器 平面偏光 电光调制器 左、右园偏振光 ?照射样品?记录 CD谱应用：游离aa 无圆二色性，所以 CD谱只与构象有关。 CD谱一般在两个区域： ① 远紫外区： 190 ~225nm附近为肽基 的吸收，因此远紫外区CD谱 呈现的是肽骨架的构象。 ② 近紫外区： 与aa侧链的构象有关。 在不同情况下，-S-S-，Trp ， Tyr，Phe等会出现不同的峰形， 可灵敏的反映出蛋白质的细微构象变化。 核磁共振法 （四） 核磁共振 (NMR， nuclear magnetic resonance ) ： (1) 原理: 自旋量子数I≠0的原子核可旋转并带电，因此而产生磁矩 (?)，在外加电场作用下沿磁场方向取向，同时发生能级分裂（占有能级数为2I+1），相邻能级能量差都是△E 。 当能量为△E=h?电磁波通过时，低能核可吸收电磁波而产生跃迁—— 核磁共振 (2) NMR谱与分子结构的关系： 化学位移 : 电子云 → 感生磁场 →对核形成屏蔽 由于电子云产生的感生磁场的屏蔽作用，引起共振时外加磁场强度的移动。 化学位移大小反映出原子核所处的化学环境、在分子中的排布，从而确定基团的性质 自旋耦合： 自旋核的磁距通过成键电子影响邻近的核，引起 后者共振谱线分裂而增多，这种相互作用——自旋耦合