拉曼光谱在生物化学中应用.docVIP

[ 上一篇 ] [ 目录 ] [ 下一篇 ] 拉曼光谱在生物化学中的应用 张文静 ??? 拉曼光谱是一种散射光谱。在301960年激光问世并将这种新型光源引入拉曼光谱后，拉曼光谱的弱点（主要是拉曼效应太弱）被攻克。拉曼光谱出现了崭新的局面。目前激光拉曼光谱已广泛应用于有机、无机、高分子、生物、环保等各个领域，成为重要的分析工具。它不仅与红外光谱相配合，可以更完整地研究分子的振动和转动能级，更好地解决有机结构的分析问题。而且由于它的一些特点，如水和玻璃的散射光谱极弱，因而在水溶液、气体、同位素、单晶等方面的应用具有突出的特长。近几年来又发展了傅里叶变换拉曼光谱仪、表面增强拉曼光谱仪、超拉曼、共振拉曼、时间分辨拉曼等新技术，激光拉曼光谱在高分子结构研究中的作用正在与日俱增。??? 作为生物化学主要研究对象的生物大分子多是处在水溶液环境中，研究它们在水溶液中的结构对于了解生物大分子的结构与性能的关系是很重要的。目前关于水溶液中生物大分子的结构（构性，构象）资料还比较少。生物大分子溶于水时结构上是否会发生变化？pH、离子强度、温度和溶剂等环境条件对生物大分子的结构会有什么影响？这些问题都有待我们去研究。由于水的红外吸收很强，因此用红外光谱发研究生物体系有很大局限性，而水的拉曼散射很弱，干扰小，而且拉曼效应对于分子构象的变化比较灵敏。此外，对生物大分子结构有重要影响的—S—S—键在红外光谱中吸收很弱，又处于低波数区（550~430-1），因而测定很困难，但它在拉曼光谱中却显示强峰。在激光拉曼光谱的测定中，样品用量很少，可低至数微克，这对生物化学体系也是非常重要的。由于上述原因，再加上激光拉曼光谱仪本身的不断改进，使激光拉曼光谱已成为一种能够快速，详尽提供有关水溶液中生物大分子结构信息的新技术。??? 生物大分子中，蛋白质、核酸、磷脂等是重要的生命基础物质，研究它们的结构、构象等化学问题以阐明生命的奥秘是当今极为重要的研究课题。应用激光拉曼光谱除能获得有关组分的信息外，更主要的是它能反应与正常生理条件（如水溶液，温度，酸碱度等）相似的情况下的生物大分子的结构变化信息，同时还能比较在各相中的结构差异，这是用其它仪器难以得到的成果。??? 多肽和蛋白质的分子链是同种或异种α－氨基酸头尾相连的肽链。这种酰胺键的振动状态有九种，如表1所示。其中酰胺Ａ，Ｂ常被ＣＨ伸缩振动和水分子振动所掩盖。酰胺Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ的拉曼线很弱，故它们都无应用价值。而酰胺Ⅰ的拉曼先强而宽，且为单线，对各种蛋白质分子差别不大，故参考价值不大。酰胺Ⅲ很少受其它振动模式的干扰，且具有强拉曼效应，是分析鉴定结构的可靠模型。 1　酰胺链的拉曼频率和归属 通常频率范围／ｃｍA ~３３００ 酰胺Ｂ ~３１００ 酰胺Ⅰ １５９７~１５７５ Ｃ－Ｎ伸缩，Ｎ－Ｈ变形 酰胺Ⅲ １２２９~７６７ Ｏ＝Ｃ－Ｎ变形 酰胺Ⅴ ６４０~６０６ Ｃ＝Ｏ变形 酰胺Ⅶ ２００ Ｃ－Ｎ扭曲 ??? 多肽，蛋白质结构的拉曼信息是较丰富的。主链酰胺Ⅰ，Ⅲ特征振动能精确地描述它们的二级结构。许多的拉曼线归属与芳香环的氨基酸残基和Ｓ－Ｓ、Ｃ－Ｓ键振动的特征频率，它们的状态与蛋白质的几何构型和性能关系很为密切。多肽和蛋白质的二级结构是指主链构型为α－螺旋、β－褶板的不规则状或它们的混合态。利用酰胺基伸缩振动频率与二级结构关系通则，可以进行定量计算。??? 核糖核酸（ＲＮＡ）是磷酸与核糖相互连结并在核糖的１`位接上腺嘌呤（Ａ）、尿嘌呤（Ｕ）、鸟嘌呤（Ｇ）或胞嘧啶（Ｃ）等核酸碱基。去氧核酸（ＤＮＡ）在核糖的２`?的对称伸缩振动（1100ｃｍ?814ｃｍ-1和1100ｃｍ-1谱线的强度比，能定量的说明有序（分子呈螺旋状）和无序构型的程度，当强度比在1.64±0.04时为100%的有序型，当比值等于０时则为完全无序型。如大肠菌甲酰甲硫氨转移核糖核酸在中性常温水溶液中的比值为1.37，它的二级结构中就含有84％的有序型，16％属无序型。PolyA·PolyU在32C时呈双股状，其碱基的成对拉曼线在1668cm-1。当加温至85°C，它离解为单股时，就出现了不成对的拉曼线1661 cm-1,这两条线的强度比能反映主链中A·U的成对程度。80年代末期发展了傅里叶变换拉曼（FT-Raman）技术，这一技术能有效地消除荧光干扰。由于高聚物样品或其中杂质的干扰，普通激光拉曼只能检测其中一小部分样品。而引入FT-Raman技术后，已能成功地检测80％以上的合成和天然高聚物，生物大分子及其它样品。 FT-Raman技术能避免荧光干扰，从而大大拓宽了Raman光谱的应用范围。FT-Raman采用1.064μm近红外区激光激发以抑制电子吸收,这样既阻止了样品的光分解又抑制了荧光的产生。同其它在拉曼光