人巨细胞病毒pul76蛋白非保守c端与蛋白聚集体-安徽医科大学学报.pdf

安徽医科大学学报　ＡｃｔａＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＭｅｄｉｃｉｎａｌｉｓＡｎｈｕｉ　２０１５Ａｐｒ；５０（４） ·４１１· ◇基础医学研究◇ 人巨细胞病毒ｐＵＬ７６蛋白非保守Ｃ端与蛋白聚集体形成的研究 １ １，２ １ 张文昌 ，陈敬贤 ，王明丽 摘要　目的　通过分别构建人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ＵＬ７６基 起细胞核内蛋白聚集体的形成。该研究通过分别构 因编码蛋白的全长以及保守Ｎ端和非保守Ｃ端的真核表达 建ｐＵＬ７６及其保守Ｎ端和非保守Ｃ端的真核表达 质粒，探讨 ｐＵＬ７６引起核内蛋白聚集体形成的决定序列。 质粒，确定了ｐＵＬ７６引起蛋白聚集体的决定序列。 方法　根据ＧｅｎＢａｎｋ中ＨＣＭＶＡＤ１６９（ＦＪ５２７５６３．１）株基因 序列设计分别用于扩增ｐＵＬ７６全长以及保守Ｎ端和非保守 １　材料与方法 Ｃ端的引物，将３段序列分别构建至增强型绿色荧光蛋白表 １．１　实验材料　ＨＣＭＶＡＤ１６９毒株由复旦大学医 达载体（ｐＥＧＦＰＮ１）中，经双酶切和测序验证重组质粒的正 学院微生物学教研室提供；人胚肺成纤维细胞（ｈｕ 确构建。空载体和３种重组质粒分别瞬时转染人胚肺成纤 维细胞（ＨＥＬＦ）和人肝癌细胞（ＨｅｐＧ２），经逆转录（ＲＴ ｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｌｕｎｇｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＨＥＬＦ）和人肝癌细胞 ＰＣＲ）和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法验证各段基因的正确表达，在荧光显 （ｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｍａ，ＨｅｐＧ２）购自美国ＡＴＣＣ公司； 微镜下观察转染不同重组质粒后细胞核内蛋白聚集体形成 ＨＥＬＦ细胞、ＨｅｐＧ２细胞用含有 １０％胎牛血清的 的状态。结果　ｐＥＧＦＰＮ１空载体和ｐＵＬ７６保守 Ｎ端均不 ＤＭＥＭ培养基（内含 １００Ｕ／ｍｌ青霉素，１００ｇ／ｍｌ链 能引起核内蛋白聚集体的形成，而ｐＵＬ７６及其非保守 Ｃ端 霉素）在３７℃、５％ ＣＯ条件下培养。ｐＥＧＦＰＮ１质 ２ 均能够引起核内蛋白聚集体的形成。结论　ｐＵＬ７６非保守Ｃ 粒购自美国Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司；脂质体２０００购自北京 端是其引起核内蛋白聚集体形成所必须的。 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＢａｍＨ 和Ｈｉｎｄ Ⅰ Ⅲ 关键词　人巨细胞病毒；ＵＬ７６；蛋白聚集体 限制性内切酶和逆转录试剂盒购自立陶宛 Ｆｅｒｍｅｎ 中图分类号　Ｒ３４９．６４ ｔａｓ公司；ＲａｂｂｉｔａｎｔｉＧＦＰ抗体、蛋白质提取试剂购 文献标志码 Ａ 文章编号 １０００－１４９２（２０１５）０４－０４１１－０５ 自上海碧云天生物技术有限公司；引物由北京 Ｉｎ 　　疱疹病毒有着相似的结构和复制周期，有一些 ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成。 １．２　方法 基因行使着相同或相近的功能，比如用于ＤＮＡ合成 １．２．１　质粒构建　ＰＣＲ分别扩增出ＨＣＭＶＵＬ７６ 的ＤＮＡ聚合酶、转录调节因子等。现已知疱疹病毒 全长、ＵＬ７６保守Ｎ端和ＵＬ７６非保守Ｃ端的编码序 家族的３个亚科中约有４０个核心基因来自共同祖 ［１］ 列。用于扩增各片段的ＰＣＲ引物如下