某基因在水稻耐盐碱中的作用.docxVIP

试验材料与方法2.1材料选择为了研究Rab基因对水稻耐盐碱的作用，需要选择一个不耐盐碱的水稻材料。通过对黑龙江省的14个常规品种进行耐盐碱评价，选择了低耐性品种LD3号作为Rab基因的转基因受体材料。2.2处理设计2.2.1转基因水稻的获得2.2.1.1水稻愈伤组织的诱导选取LD3号的成熟种子，去掉颍壳，挑选表面无菌斑且饱满的种子进行消毒。消毒的步骤为：首先把选好的种子放入100ml的无菌三角瓶中，用70%的酒精消毒一分钟；然后把酒精倒干再加入3%的溶液100ml（加水70ml,30ml配置而成），放入摇床中震荡一小时进行第二次消毒；最后倒掉溶液，用蒸馏水冲洗种子五遍，第六遍用蒸馏水浸泡半小时。2.2.1.2诱导与继代培养将消过毒的种子放在无菌滤纸上，用滤纸吸干表面的蒸馏水，切除胚乳，将成熟胚置于愈伤诱导培养基中，每个培养皿中放入12颗，放好后用封口膜把培养皿的口封好，再放在26的培养箱中暗培养10天，然后在超净工作台上打开培养皿并进行操作，用镊子挑取状态好的愈伤组织在相同的条件下进行继代培养2周。2.2.1.3农杆菌培养取出已经转入载体的农杆菌菌种用含50mg/L利福平、125mg/L壮观霉素的液体培养基在26下震荡培养16个小时，再用农杆菌菌株在50mg/L利福平、125mg/L壮观霉素的固体培养基上划线接种，28静止培养2天，2天后将农杆菌刮入到AAM培养基中，28震荡培养3小时。最后利用分光光度计来测定菌液浓度并将菌液浓度调到0.5-1.0的范围内。这就是共培养转化水稻要用的农杆菌悬浮液。2.2.1.4感菌与共培养将培养后的愈伤组织加入到调好的农杆菌悬浮液中，侵染30分钟，在这个时间内每五分钟摇动一次。倒去菌液，将愈伤组织放在无菌的滤纸上吸掉表面菌液，保证把表面的菌液吸干净后将愈伤组织放在共培养基上，20暗培养3天。2.2.1.5愈伤组织的抗生素筛选 将共培养后的愈伤组织取出，用蒸馏水摇动清洗4遍，第五遍用蒸馏水浸泡10分钟，倒掉含菌体的蒸馏水，再用含400mg/L头孢的蒸馏水浸泡20分钟，过后用含400mg/L头孢的蒸馏水冲洗愈伤组织一次，最后将放在滤纸上晾干3小时。将愈伤组织放进含50mg/L潮霉素的筛选培养基中，26暗培养两周，之后转入到新的筛选培养基上在相同培养基下继续培养两周。2.2.1.6愈伤组织的诱导分化和生根将生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含50mg/L潮霉素的分化培养基中暗培养3天，转到一天有15小时的光照下进行培养，长出的小苗用1/2MS生根壮苗14天。将根系健壮的植株带到进行移栽入土并编号。2.2.2 PCR鉴定从转基因植株收获水稻种子中选六个编号，依次为R16,R21,R23,R25,R26,R28。把这六类种子分别放在不同的花盆中进行育苗。2.2.2.1 DNA提取分别在以上六类小苗中剪取叶片放入事先编号的小瓶中；把叶子放入研钵中并加入20ulCTAB溶液进行研磨；把研磨好的液体倒入离心管中震荡一会儿，65温浴40分钟；加入700ul氯仿震荡摇匀，1000转离心10分钟；吸上清加入等体积异丙醇700ul,-20下放置，12000离心15分钟；去上清，加600ul,75%的乙醇，震荡摇匀，12000离心十五分钟；去上清，吸干乙醇，加入25ul去离子水溶解。2.2.2.2电泳检测如表2-1中依次加入试剂（因为有10种不同的模板，所以用11倍的PCR反应体系）。采用的引物有两种：引物A(41ubiq1,42ubiq2)、引物B(43ubiq3,44Rab-R)。加引物A时，PCR是对启动子进行扩增，加引物B时PCR是对目的基因Rab进行扩增。模板分别是PUR,PCU,LD,转入了空载体的LD,R16,R21,R23,R25,R26,R28。其中PCU中转入的是含启动子的载体，PUR中转入了既含有启动子也含有目的基因的转体。全部加好后在离心管中滴一滴矿物油，因为进行PCR时反应温度高，易蒸发，用矿物油进行保护。最后将离心管放入PCR仪器中进行扩增。PCR仪器设置：阶段一——预变性：94,2min；阶段二——变性：94，30秒、退火：58,30秒、延伸：72,1min。循环35次；阶段三——延伸：72,3min。 表2-1 PCR反应体系试剂 1倍试剂(ul) 11倍试剂(ul) 13 143 2 22 2 220.3 3.3模板2 22引物2