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微生物实验指导书 实验一普通光学显微镜的使用维护 一、实验目的： 1、掌握显微镜的构造原理及性能。 2、熟练掌握显微镜的操作方法 3、初步了解血球计数板的使用方法。 二、实验原理： 1、显微镜的实验原理：普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因： ①增加照明亮度② ? 增加显微镜的分辨率。 2、血球计数板的构造原理：血球计数板是一块特制的厚的载玻片，其上由四条竖槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短的横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格为计数室。 计数室的刻度有两种规格即16×25或25×16的。现在常用25×16的，即计数室（一个大方格）分成25个中方格，每个中方格由分为16个小方格。 左上 右上 中心 左下 右下 三、材料与仪器： 1、仪器：显微镜 、载玻片、盖玻片、牙签、血球计数板 2、材料：擦镜纸、元葱 四、实验步骤： （一）显微镜练习： 1、制片：用牙签挑少许元葱表皮放在载玻片上，然后加盖盖玻片。 2、观察：低倍镜 高倍镜 （二）血球计数板的练习：先用低倍镜查找中方格，再用高倍镜查找小方格，按照左上、左下、右上、右下、中心格练习。 实验 革兰氏染色法一、目的要求 了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。二、基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。三、器材 　　大肠杆菌枯草芽孢杆菌； 　　革兰氏染色液载玻片显微镜等。 　　四、操作步骤 　　1．涂片将培养14—16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 　　2．染色 　　（1）初染 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 　　（2）媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 　　（3）脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒钟，立即用水冲净酒精。 　　（4）复染 用番红液染1—2分钟，水洗。 （5）镜检 干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 　五、报告　大肠杆菌枯草芽孢杆菌 实验三 霉菌形态的观察 一、目的要求： 1、学习观察霉菌的方法。 2、掌握几种常用霉菌的形态特征。 3、学会霉菌制片技术。 4、了解霉菌的形态构造及菌落特征。 二、基本原理： 霉菌是具有分枝的菌丝体，菌丝体及孢子的形态是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝较粗大，一般在低倍镜下即可观察到，观察霉菌常用的方法有： 1、直接制片观察法：将培养物置于乳酸石炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片镜检，用此染液制成的霉菌制片的特点是细胞不变形，具有防腐作用，不易干燥，能保持较长时间，防止孢子飞散。必要时，可用树胶封固，制成永久标本长期保存。 2、载玻片